Днк чипы принципы работы генетика. Методы днк-чипов

Юная калифорнийская компания Affymetrix (начавшая свою работу в 1993 году) - один из фаворитов рынка устройств для генетических исследовательских работ.

Компания известна своим революционным соединением технологий полупроводниковой, так сказать, «микросхемной», индустрии и биохимических тестов.

ДНК-чипы от Affymetrix обширно употребляются в различных лабораториях, занятых генетическим анализом и генной инженерией.

Но обыденным людям куда увлекательнее другой продукт компании. Это прибор, схожий на микросхему, позволяющий идентифицировать 10-ки ДНК от разных животных в образчике людской еды.

bioMerieux FoodExpert-ID практически - разновидность так именуемого GeneChip.

Прибор может идентифицировать био следы в еде от 12 разновидностей млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 разновидностей рыбы.

Таким макаром, он позволяет выяснить, вправду ли гусиный паштет, вызывающий у покупателя подозрения, содержит гусиную печень, а не что-то ещё.

ДНК-чип создаётся по технологиям, схожим с компьютерными, но это не электрический, а био объект (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

А, например, мусульмане могут проверить - не положили ли нерадивые изготовители свинину в «говяжьи» котлеты.

Всё это, правда, работает, только с привлечением дополнительных лабораторных способностей, так что использовать чип в «нагом» виде, на коленке, обычному потребителю не получится.

Чтоб осознать, как работает FoodExpert-ID, необходимо вспомнить самую малость из генетики: двойные спирали ДНК, составляющие их молекулы-основания - аденин, гуанин, тимин и цитозин, также то, что они могут соединяться только попарно, как будто ключи и замки.

ДНК-чип содержит мириады и мириады «располовиненных» фрагментов ДНК-кода.

Кусок поверхности чипа с молекулами-ключами (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

Поверхность чипа размером с ноготь разбита на 97 тыщ квадратиков, нареченных «особенностями».

Любая «особенность» поперечником примерно 26 микронов содержит только один ДНК-код. Поточнее много-много схожих молекул.

И они все совершенно точно относятся к одному из 33 животных.

Длина каждого куска - 17 оснований. Этого довольно для надёжной идентификации, как довольно 17 взятых попорядку в любом месте нот, чтоб найти какую-нибудь мелодию из имеющейся базы данных.

Целую россыпь разбитых кусочков ДНК экспериментаторы выделяют из эталона еды. Чего там только нет. А чего?

«Некорректные» куски генетических кодов смываются, а совпадающие - закрепляются на чипе. Красноватые шарики - флуоресцентные молекулы (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

Добавим к молекулам, составляющим генетический код, молекулы флуоресцирующего вещества. Нанесём эту смесь на поверхность FoodExpert-ID. Осталось сделать малость.

Все совпадающие куски кода объединятся со своими «родными» последовательностями в той либо другой «особенности».

Сейчас чип можно помыть водой - всё избыточное уйдёт. Чип помещают под луч лазера, и квадратики, содержащие отловленный материал будут ярко сиять. Осталось только свериться с картой чипа, чтоб выяснить - какие ДНК определены.

А по интенсивности свечения можно сделать косвенный вывод и о пропорциях свинины и говядины в нашей гипотетичной котлете.

Как лицезреем, внедрение чипа сравнимо нетрудно, и позволяет заниматься генетическим анализом лабораториям, имеющим очень обычный набор оборудования.

Но как же хитроумно создание чипа. Чтоб создавать такие биохимические шедевры автоматизировано и в массовом порядке, Affymetrix соединила принципы фотолитографии и комбинаторной химии.

Цветные квадратики - «особенности», отвечающие за идентификацию того либо другого ДНК-кода (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

Начальный продукт - кварцевая пластинка - покрывается особым реактивом, силаном, который крепко соединяется с кварцем и сформировывает строго периодичную молекулярную матрицу (с равномерной поверхностной плотностью), готовую принять нуклеотиды.

В цепочках грядущего кода основания идут вертикально ввысь, а наносят их сразу на всю поверхность, слой за слоем.

Очевидно, всякий раз на чип подают определённое вещество, и чтоб оно закрепилось исключительно в определённых «особенностях», тех микронных квадратиках, употребляют маски, подобные тем, что необходимы для производства микросхем.

Снимок прореагировавшего чипа с огромным повышением. Белоснежные, красноватые, жёлтые квадратики - участки с высочайшей концентрацией флуоресцентного вещества. Зелёные, голубые, чёрные - соответственно, со всё более и поболее с низкой (иллюстрация с веб-сайта affymetrix.com).

С основой чипа всякий раз сцепляются только те основания, что освещаются через отверстия в маске ультрафиолетом.

В этом процессе поочередного синтеза главное - всякий раз накладывать новейшую маску с микронной точностью, по другому все генетические коды на пластинке перемешаются.

Так, шаг за шагом (в пищевом чипе их 17, в других моделях компании - до 24) формируются вертикальные столбики нуклеотидных цепей, которые и делают ключи-анализаторы генов.

Эта разработка служит, естественно, не только лишь для таких смешных (на 1-ый, может быть, взор) областей внедрения, как выявление мяса поросёнка в гусином паштете, да и для полностью серьёзных исследований.

Ведь на поверхность чипа, на теоретическом уровне, можно нанести куски каких угодно генетических кодов.

Работа Affymetrix - избыточное подтверждение, что самые достойные внимания и многообещающие открытия происходят на соединениях наук и дисциплин.

Похоже на био обилие в природе, получаемое смешением генов. Не так ли?

ДНК-микрочипы

ДНК-чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК-чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК-чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века . В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.

ДНК-чип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие - 15-25 нуклеотидов, длинные - 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты - от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото . Наиболее распространенные подложки - из стекла.

Белковые и пептидные чипы

Для анализа продуктов трансляции генов используют чипы, построенных на основе полипептидов. Большинство лекарственных мишеней являются белками, следовательно, белковые и пептидные чипы могут быть полезны для поиска новых лекарств. Белковые микрочипы могут оказаться чрезвычайно полезными в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для определения иммунного статуса организма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфических аллергенов. Микрочипы, представляющие собрание основных антигенов главных патогенных организмов (бактерии, грибы и вирусы), позволяют анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции.Большое значение в развитии белковых микрочипов имеют способы регистрации сигналов. К ним относятся: самый первый из известных методов - РИА (радиоиммунологический анализ), применяющий радиоактивную метку, иммуноанализ с использованием флуоресцентных меток - ФИА и иммуноферментный анализ (ИФА), в котором меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с молекулой антитела. В качестве меток в ИФА выбираются высокоактивные стабильные ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.). Преимуществом ИФА является возможность многократного усиления сигнала. В последние годы разработаны чувствительные системы субстратов, дающих нерастворимые флуоресцирующие продукты, например, ELF-97 . Очевидно, что процесс изготовления белкового микрочипа должен включать процедуру закрепления, иммобилизации на микрочипе. Выбор метода определяется многими параметрами - природой исходного субстрата, последующей областью применения микрочипа и т.д. Белковые микрочипы активно применяются, прежде всего, для анализа всех известных (и доступных) биологических жидкостей, включая сыворотку/плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, слезную жидкость, амниотическую жидкость, и др.

Современные крошечные ДНК-чипы, заменяющие целые генетические лаборатории, способны «угадать мелодию», то есть определить ген, всего по нескольким нотам-молекулам. Для того, чтобы это стало возможным, учёным пришлось скрестить полупроводниковые технологии с биохимией.

Молодая калифорнийская компания Affymetrix (начавшая свою работу в 1993 году) — один из лидеров рынка приборов для генетических исследований.

Фирма известна своим революционным соединением технологий полупроводниковой, так сказать, «микросхемной», промышленности и биохимических экспериментов.

ДНК-чипы от Affymetrix широко используются в разных лабораториях, занятых генетическим анализом и генной инженерией.

Но обычным людям куда интереснее другой продукт компании. Это прибор, похожий на микросхему, позволяющий идентифицировать десятки ДНК от различных животных в образце человеческой пищи.

bioMerieux FoodExpert-ID фактически — разновидность так называемого GeneChip.

Прибор может идентифицировать биологические следы в пище от 12 разновидностей млекопитающих, 5 видов домашней птицы и 16 разновидностей рыбы.

Таким образом, он позволяет узнать, действительно ли гусиный паштет, вызывающий у покупателя подозрения, содержит гусиную печень, а не что-то ещё.

ДНК-чип создаётся по технологиям, сходным с компьютерными, но это не электронный, а биологический объект (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

А, к примеру, мусульмане могут проверить — не положили ли недобросовестные изготовители свинину в «говяжьи» котлеты.

Всё это, правда, работает, лишь с привлечением дополнительных лабораторных возможностей, так что использовать чип в «голом» виде, на коленке, простому потребителю не удастся.

Чтобы понять, как работает FoodExpert-ID, нужно вспомнить самую малость из генетики: двойные спирали ДНК, составляющие их молекулы-основания — аденин, гуанин, тимин и цитозин, а также то, что они могут соединяться только попарно, словно ключи и замки.

ДНК-чип содержит мириады и мириады «располовиненных» фрагментов ДНК-кода.

Фрагмент поверхности чипа с молекулами-ключами (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

Поверхность чипа размером с ноготь разделена на 97 тысяч квадратиков, названных «особенностями».

Каждая «особенность» поперечником приблизительно 26 микронов содержит лишь один ДНК-код. Точнее много-много одинаковых молекул.

И все они однозначно относятся к одному из 33 животных.

Длина каждого фрагмента — 17 оснований. Этого достаточно для надёжной идентификации, как достаточно 17 взятых подряд в любом месте нот, чтобы определить какую-нибудь мелодию из имеющейся базы данных.

Целую россыпь разбитых кусочков ДНК экспериментаторы выделяют из образца пищи. Чего там только нет. А чего?

«Неправильные» фрагменты генетических кодов смываются, а совпадающие — закрепляются на чипе. Красные шарики — флуоресцентные молекулы (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

Добавим к молекулам, составляющим генетический код, молекулы флуоресцирующего вещества. Нанесём эту смесь на поверхность FoodExpert-ID. Осталось сделать немного.

Все совпадающие фрагменты кода соединятся со своими «родными» последовательностями в той или иной «особенности».

Теперь чип можно промыть водой — всё лишнее уйдёт. Чип помещают под луч лазера, и квадратики, содержащие отловленный материал будут ярко светиться. Осталось лишь свериться с картой чипа, чтобы узнать — какие ДНК определены.

А по интенсивности свечения можно сделать косвенный вывод и о пропорциях свинины и говядины в нашей гипотетической котлете.

Как видим, использование чипа сравнительно несложно, и позволяет заниматься генетическим анализом лабораториям, имеющим весьма простой набор оборудования.

Но насколько же хитроумно производство чипа. Чтобы создавать такие биохимические шедевры автоматизировано и в массовом порядке, Affymetrix соединила принципы фотолитографии и комбинаторной химии.

Цветные квадратики — «особенности», отвечающие за идентификацию того или иного ДНК-кода (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

Исходный продукт — кварцевая пластина — покрывается специальным реактивом, силаном, который прочно соединяется с кварцем и формирует строго периодичную молекулярную матрицу (с равномерной поверхностной плотностью), готовую принять нуклеотиды.

В цепочках будущего кода основания идут вертикально вверх, а наносят их одновременно на всю поверхность, слой за слоем.

Разумеется, каждый раз на чип подают определённое вещество, и чтобы оно закрепилось только в определённых «особенностях», тех самых микронных квадратиках, используют маски, аналогичные тем, что нужны для производства микросхем.

Снимок прореагировавшего чипа с большим увеличением. Белые, красные, жёлтые квадратики — участки с высокой концентрацией флуоресцентного вещества. Зелёные, синие, чёрные — соответственно, со всё более и более с низкой (иллюстрация с сайта affymetrix.com).

С основой чипа каждый раз сцепляются лишь те основания, что освещаются через отверстия в маске ультрафиолетом.

В этом процессе последовательного синтеза главное — каждый раз накладывать новую маску с микронной точностью, иначе все генетические коды на пластине перемешаются.

Так, шаг за шагом (в пищевом чипе их 17, в других моделях фирмы — до 24) формируются вертикальные столбики нуклеотидных цепей, которые и создают ключи-анализаторы генов.

Эта технология служит, конечно, не только для таких забавных (на первый, возможно, взгляд) областей применения, как выявление мяса поросёнка в гусином паштете, но и для вполне серьёзных научных исследований.

Ведь на поверхность чипа, теоретически, можно нанести фрагменты каких угодно генетических кодов.

Работа Affymetrix — лишнее доказательство, что самые интересные и перспективные открытия происходят на стыках наук и дисциплин.

Похоже на биологическое разнообразие в природе, получаемое смешением генов. Не так ли?

Биологические микрочипы (biochips) или, как их чаще называют -microarrays, - это один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века.

Введение

Изобретены биочипы были в конце 90-х годов в России и в США. Технология микрочипов – это принципиально новый уровень лабораторных исследований, так как она позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Тысячи молекул ДНК или белков помещаются на стеклянные пластинки для создания ДНК- и белковых чипов соответственно. На основании экспериментальных данных сотрудниками лаборатории клеточной инженерии под руководством д.б.н. Белецкого И. П. Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики (г. Пущино Московская обл.) была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК-чипов, а также их использования при гибридизационном анализе ДНК. В его основе лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов. Биочипы используются для самых разных целей. В медицине биочипы помогают за считанные часы обнаруживать у больных лекарственно устойчивые формы туберкулеза и лейкоза, а так же некоторые виды раковых заболеваний. Биочипы являются незаменимым инструментом для биологов, которые могут сразу, за один эксперимент, увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов.

Биохимические микрочипы

Биохимические микрочипы, технологии производства и внедрения которых активно развиваются в России и за рубежом, являются сильнейшими из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. В основе применения микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий нанесенных на подложку.

К главным причинам широкого распространения биочиповых исследований относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства. Биочипы применяются для обнаружения бактериальных и вирусных контаминаций в продуктах питания, косметике и окружающей среде, выявления генно-модифицированных организмов в пищевых продуктах, диагностики и прогнозирования различных заболеваний, детекции особо опасных инфекционных агентов в анти-биотеррористических целях и др.

ДНК-микрочипы

ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.

ДНК–чип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото. Наиболее распространенные подложки – из стекла.

Белковые и пептидные чипы

Для анализа продуктов трансляции генов используют чипы, построенных на основе полипептидов. Большинство лекарственных мишеней являются белками, следовательно, белковые и пептидные чипы могут быть полезны для поиска новых лекарств. Белковые микрочипы могут оказаться чрезвычайно полезными в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для определения иммунного статуса организма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфических аллергенов. Микрочипы, представляющие собрание основных антигенов главных патогенных организмов (бактерии, грибы и вирусы), позволяют анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции.Большое значение в развитии белковых микрочипов имеют способы регистрации сигналов. К ним относятся: самый первый из известных методов – РИА (радиоиммунологический анализ), применяющий радиоактивную метку, иммуноанализ с использованием флуоресцентных меток – ФИА и иммуноферментный анализ (ИФА), в котором меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с молекулой антитела. В качестве меток в ИФА выбираются высокоактивные стабильные ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.). Преимуществом ИФА является возможность многократного усиления сигнала. В последние годы разработаны чувствительные системы субстратов, дающих нерастворимые флуоресцирующие продукты, например, ELF-97. Очевидно, что процесс изготовления белкового микрочипа должен включать процедуру закрепления, иммобилизации на микрочипе. Выбор метода определяется многими параметрами - природой исходного субстрата, последующей областью применения микрочипа и т.д. Белковые микрочипы активно применяются, прежде всего, для анализа всех известных (и доступных) биологических жидкостей, включая сыворотку/плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, слезную жидкость, амниотическую жидкость, и др.

Углеводные микрочипы

Многие природные биомолекулы (белки, липиды) модифицированы сахарными остатками. Часто биологические процессы включают связывание сахаров с рецепторами, и микрочипы могут стать важным инструментом в исследовании таких взаимодействий. Гликолипиды, нанесенные на нитроцеллюлозу или поливинилиденфторид, представляют пример углеводных микрочипов. Эти гликолипиды взаимодействуют с белками с известной углевод-связывающей специфичностью для подтверждения предсказанных олигосахарид-белковых взаимодействий. Связывание углеводов с мембранами регистрируют с помощью флуоресцентно меченых гликолипидов. Углеводный состав связавшегося компонента определяют in situ масс-спектрометрически. Важно отметить, что олигосахариды, связанные с липидом, могут иметь различное происхождение, например, гликопротеины, протеогликаны, гликолипиды, целые клетки и синтетические олигосахариды. Таким образом, по взаимодействию олигосахаридов, последовательность которых известна, с мембраной могут быть идентифицированы конкретные связанные с сахарами белковые мотивы. И, наоборот, путем связывания неизвестных олигосахаридов с мембраной можно отобрать белки с известной структурой, чтобы определить, с какими олигосахаридами они связаны.

Тканевые микрочипы

Данные по анализу экспрессии генов только начинают давать нам важную информацию о биологической функции генов, их потенциальном клиническом влиянии или их пригодности в качестве мишени для лекарства. В то же время традиционный гистологический анализ образцов ткани требует больших затрат времени: ткани выдерживают в формалине, помещают в парафин, делают срезы и только затем красят и проводят микроскопический анализ на индивидуальных стеклах. В 1998 году для такого анализа впервые были изготовлены тканевые микрочипы посредством нанесения на одну подложку многих образцов ткани.

Изготовление микрочипа включает объединение до тысячи иголочных биопсий, взятых из помещенных в парафин образцов ткани, в парафиновом блоке с определенными координатами. Из этого блока делается до 300 срезов, которые переносятся на стекло для прокрашивания и анализа. Таким образом, из одного блока может быть произведено до 300 тысяч анализов. При этом такой способ вызывает минимальное повреждение ткани.

Приготовленные один раз, микрочипы могут быть испытаны на взаимодействие с различными молекулярными мишенями – ДНК, РНК или белками – в сотнях или даже тысячах образцах ткани. Принципиальное отличие тканевых чипов от, например, ДНК-чипов заключается в том, что в последнем случае определяется экспрессия тысяч генов в одной ткани/образце, тогда как в первом – один ген в тысяче различных тканей/образцов. Преимущество анализа с использованием тканевых микрочипов состоит в том, что все образцы ткани обрабатываются одинаковым способом, т.е. концентрации реагентов, время инкубации, температура и состав растворов неизменны. При этом для анализа требуется всего десятые или сотые доли миллилитра реагентов.

Тканевые микрочипы довольно активно используются для поиска маркеров, ассоциированных с теми или иными заболеваниями, в первую очередь, с онкологическими. Показаны примеры успешного применения тканевых чипов для анализа аутоиммунных заболеваний, сердечной недостаточности, диабета и нейродегенеративных патологий.

Порядок проведения анализа ДНК с использованием биочипов

Олигонуклеотидный зонд, модифицированный фосфатной группой по 5-концу, пришивали к стеклу с помощью конденсирующего агента (карбодиимида в присутствии имидазола). Затем проводили гибридизацию с олигонуклеотидным фрагментом, меченным биотином, и цветную пероксидазную реакцию с помощью стрептавидин-пероксидазного конъюгата. По интенсивности окраски окисленного субстрата – диметиламинобензидина (ДАБ) – судили о результате анализа.

Изготовление биологических чипов

На основании экспериментальных данных была разработана технология для крупномасштабного изготовления стеклянных подложек при производстве ДНК-чипов. Для широкого применения чиповых технологий необходимы простые, дешевые и эффективные методы изготовления в больших масштабах и контроля модифицированных подложек, содержащих поверхностные аминогруппы.. Наиболее часто используемыми твердыми подложками для изготовления микрочипов являются стекла, обработанные различными аминоалкилтриалкоксисиланами, например APTES (3-аминопропилтриэтоксисилан, Рис.3) для получения модифицированной поверхности.

Рис.3 Структурная формула APTES. а-в свободном состоянии, б-модифицированная на стекле

Такая поверхность является гидрофобной и позволяет наносить зонды с максимальной плотностью. Как следует из литературных данных, условия получения амино-модифицированной стеклянной подложки могут быть весьма разнообразными. Это касается как концентрации APTES, так и выбора растворителя, который, в свою очередь, может содержать различное количество воды. Для изготовления амино-модифицированных подложек в больших масштабах желательно использовать как можно менее токсичные и дешевые растворители, такие как ацетон и этанол. Показано, что природа органического растворителя практически не влияет на качество получаемых стекол. Активация нуклеиновых кислот осуществляется при помощи карбодиимидов(CDI)- это один из ранних методов получения аффинных сорбентов, который до сих пор остается достаточно распространенным. В основе метода лежит способность карбодиимидов активировать концевую фосфатную группу нуклеиновых кислот. Активированные карбодиимидом олигонуклеотиды легко вступают в реакцию с амино- или сульфгидрильными группами носителей. К настоящему времени достаточно подробно изучен механизм активации карбодиимидами фосфатных групп олигонуклеотидов. Лимитирующей стадией реакции является протонирование карбодиимидов с образованием промежуточных неустойчивых реакционноспособных О-фосфорилизомочевины. Достаточно сильные нуклеофильные группы носителя могут ингибировать эту стадию

Кроме того, протонированные нуклеофильные группы не способны вступать в реакцию с соединениями 1 [Рис.4]. Вследствии этого выход конечного продукта 2 при использовании полимеров с высокоосновными группами может уменьшиться. Замещенные О-фосфорилизомочевины 3 способны также трансформироваться в побочные продукты, например гидролизоваться с высвобождением исходной фосфатной группы и мочевины, либо претерпевать ряд последовательных превращений с образованием пирофосфатов, полифосфатов и производных О-фосфорилизомочевины. Последние, в свою очередь, могут дать нереакционноспособные производные N-пирофосфорилмочевины 3 или N-фосфорилмочевины 4.

Для увеличения эффективности иммобилизации нуклеотидов на полимер активацию карбодиимидами проводят в присутствии нуклеофильного катализатора – имидазола, образующий соответствующий фосфамид олигонуклеотидов, который после протонирования остатков азола является высокореакционноспособным соединением по отношению к нуклеофилам. Чаще всего получаются фосфоимидазолиды 5 (Рис. 5)

Преимуществом этого подхода является отсутствие ряда побочных реакций, поскольку производное 5 стабильнее, чем О-фосфорилмочевина 1. Соединение 5 более эффективно взаимодействует с аминогруппой носителя, что способствует увеличению выхода при иммобилизации.

Проведение гибридизации.

В основе гибридизационного анализа лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов (Рис.6,б). Известные в настоящее время реакции можно разделить на две большие группы. Первая группа методов основана на амплификации – циклически повторяющейся репликации in vitro искомого фрагмента ДНК (РНК). Амплифицированный фрагмент затем выявляется путем электрофореза в геле. Ко второй группе относятся методы прямого обнаружения специфической последовательности нуклеотидов (ДНК или РНК) при помощи коротких олигонуклеотидных одноцепочечных фрагментов, имеющих репортерную группу (зонд). Эти реакции получили название ДНК-зондирования. Их чувствительность зависит от вида используемого зонда и может быть весьма высокой. Наиболее распространенной нерадиоактивной репортерной группой, включаемой в состав олиго- и полинуклеотидных зондов, является витамин биотин (природный кофактор группы ферментов – карбоксилаз) (Рис 6,А)

Рис. 6 Схема метода гибридизационного анализа на примере идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения. А – ПЦР с использованием праймеров меченных биотином - индекс (мБ); Б – гибридизация ПЦР продуктов со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе - индекс (и)

Биотинилированное производное дУТФ (био-УТФ) включается в образуемые ДНК-полимеразами цепи вместо тимина и способно к комплементарным взаимодействиям с аденином.

Биотин – соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте. Он является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования). Биотин легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами. В большом количестве биотин содержится в белках птичьих яиц, где он связан с гликопротеидом авидином, имеющим молекулярную массу 68 кДа. Биотин обладает чрезвычайно высоким сродством к авидину, а также к его бактериальному аналогу – стрептавидину (константа диссоциации комплекса биотин-авидин 10-15 М) и образуeт чрезвычайно стойкий комплекс (КА=10 в 15-той степени на моль в минус 1-й степени).

Проведение пероксидазной реакции

Для проведения пероксидазной реакции используется коньюгат, состоящий из фермента, связанного со стрептавидином. Этот коньюгат образует очень прочный комплекс биотин-стрептавидин, который используется как связующий мостик между образовавшимся в ходе гибридизации дуплексом ДНК и ферментной меткой.

Наибольшее распространение в качестве ферментной метки получила пероксидаза хрена, которую впервые применили Накане и Пирс. Одна молекула фермента, конъюгированная со стрептавидином, способна "обработать" большое количество молекул субстрата. Под действием пероксидазы, субстрат H2O2 образует с красителем диаминобензидином (ДАБ) нерастворимый в воде и спирте комплекс коричневого цвета, который накапливается вокруг фиксированного дуплекса.

Обработка результатов анализа

Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов "EuroBioWto Биоконтроль" и компьютерной программы "MedGen". Полученную на экране компьютера гибридизационную картину для анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной для положительного контроля (заведомо трансгенной ДНК) и гибридизационной картиной для отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК). Пример схемы гибридизационной картины биологического микрочипа приведен на рис.9.

Рис. 9 Пример схемы биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождяения.PC положительный контроль, NC отрицательный контроль, Lect-ген белка сои, Zein-ген белка кукурузы, Gus, Nos, 35s, Npt, Ocs-трансгенные последовательности

Наличие яркого специфического окрашивания биологического микрочипа в местах, содержащих иммобилизационные олигонуклеотиды (для промоторов 35S и Nos, терминатора Ocs, генов Gus или NptII) , свидетельствует о присутствии конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о трансгенности анализируемой ДНК. Отсутствие окраски после анализа указывает на отсутствие конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т. е. о нетрансгенности анализируемой ДНК. Наличие окрашивания NC cвидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты (1 моль/дм в кубе), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.

Анализ с использованием биочипов находит в настоящее время широкое применение на практике. Он отличается высокой чувствительностью, простотой процедуры выполнения, возможностью одновременного анализа множества параметров, специфичностью и воспроизводимостью. Применение биологических микрочипов может быть очень эффективно в таких сферах деятельности, как: обнаружение контаминации в продуктах питания и окружающей среде, диагностика и прогнозирование заболеваний, обнаружение элементов биологического оружия, оценка лекарственной эффективности. Разработка биочиповых технологий в РФ является одной из тех высоко-технологичных областей, которой уделяется особое внимание.

Список литературы

1. Шляпникова Е. А. , Шляпников Ю. М. , Афанасьев В. Н. , Афанасьева Г. В. , Гаврюшкин А. В. , Белецкий И. П. . Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа.// Биоорганическая химия 2006 №4 С.68-86.

2. Шляпникова Е. А., Шляпников Ю. М., Грановский И. Э., Афанасьева Г. В., Гаврюшкин А. В., Белецкий И. П. "Биологические микрочипы в медицине" Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

3. Timofeev E., Mirzabekov A. (1998) Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manifacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips and protein microchips. Anal.Biochem., 259, 34-41.

4. Шишкина И. Г., Левина А. С., Зарытова В. Ф. "Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их фрагменты" //Успехи химии// 2001. №70(6).С.581,.

5. Makretsov N.A., Huntsman D.G., Nielsen T.O., Yorida E., Peacock M., Cheang M.C., Dunn S.E., Hayes M., van de Rijn M., Bajdik C., Gilks C.B. (2004) Hierarchical clustering analysis of tissue microarray immunostaining data identifies prognostically significant groups of breast carcinoma. Clin Cancer Res., 10(18 Pt 1), 6143-6151.

6. Hu S., Loo J.A., Wong D.T. (2006) Human body fluid proteome analysis. Proteomics, 6(23), 6326-6353.

7. Ekins R.P. (1987) An overview of present and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12-22.

8. Fukui S. et al. (2002) Oligosaccharide microarrays for high-throughput detection and specificity assignments of carbohydrate-protein interactions. Nat.Biotechnol.20, 1011-1017.

9. Kononen J. et al. (1998) Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumour specimens. Nat.Med. 4, 844-847/

10. Wang et al. (2002) Carbohydrate microarrays for the recognition of cross-reactive molecular markers of microprobes and host cells. Nat.Biotechnol.20, 275-281.

11. Perkel J.M.(2002) Tissue microarrays: advancing clinical genomics. The Scientist 21, 39.

12. Helmchen B., Weckauf H., Ehemann V., Wittmann I., Meyer-Scholten C., Berger I. (2005) Expression pattern of cell cycle-related gene products in synovial stroma and synovial lining in active and quiescent stages of rheumatoid arthritis. Histol Histopathol., 20(2):365-372.

13. Hueber W., Kidd B.A., Tomooka B.H., Lee B.J., Bruce B., Fries J.F., Sonderstrup G., Monach P., Drijfhout J.W., van Venrooij W.J., Utz P.J., Genovese M.C., Robinson W.H. (2005) Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum.; 52(9), 2645-2655.

14. Mobasheri A., Airley R., Foster C.S., Schulze-Tanzil G., Shakibaei M. (2004) Post-genomic applications of tissue microarrays: basic research, prognostic oncology, clinical genomics and drug discovery. Histol Histopathol., 19(1), 325-335.

15. Мелентьева Г.А.. Фармацевтическая химия. Том 2, Москва "Медицина" 1976. С.68

Гибридизационный анализ ДНК с использованием биологических микрочипов

ДНК-микрочип (англ. DNA microarray) - это сложная технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. ДНК-микрочип представляет собой небольшую поверхность, на которую с большой плотностью в определённом порядке нанесены фрагменты одноцепочечной синтетической ДНК с известной последовательностью. Эти фрагменты выступают в роли зондов, с которыми гибридизуются (образуют двуцепочечные молекулы) комплементарные им цепи ДНК из исследуемого образца, обычно меченные флуоресцентным красителем. Чем больше в образце молекул ДНК с определенной последовательностью, тем большее их количество свяжется с комплементарным зондом, и тем сильнее будет оптический сигнал в точке микрочипа, куда был «посажен» соответствующий зонд. После гибридизации поверхность микрочипа сканируется, и в результате каждой последовательности ДНК ставится в соответствие тот или иной уровень сигнала, пропорциональный числу молекул ДНК с данной последовательностью, присутствующих в смеси.

В обычном ДНК микрочипе (н-р, производства Affymetrix) зонды прикрепляются к твердой поверхности - стеклянному или силиконовому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твердых поверхностей. Технология ДНК-микрочипов находит самые разнообразные применения в современной биологии и медицине для анализа сложных смесей ДНК - например, совокупности всех транскриптов (матричных РНК) в клетке. ДНК микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов , выявления однонуклеотидных полиморфизмов , генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов . Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.

Пример использования ДНК-микрочипа

Ниже приводится пример эксперимента с использованием ДНК-микрочипа.

1. Выделяются или выращиваются биологические образцы, которые необходимо сравнить. Они могут соответствовать одним и тем же индивидуумам до и после какого-либо лечения (случай парных сравнений), либо различным группам индивидуумов, например, больным и здоровым, и т. д.
2. Из образца выделяется очищенная нуклеиновая кислота, являющаяся объектом исследования: это может быть РНК в исследовании профиля экспрессии генов , ДНК при изучении сравнительной геномной гибридизации и т.д. Данный пример соответствует первому случаю.
3. Проверяется качество и количество полученной нуклеиновой кислоты. Если требования соблюдены, эксперимент может быть продолжен.
4. На основе имеющихся образцов РНК в процессе обратной транскрипции синтезируются последовательности комплементарных ДНК (кДНК, англ. cDNA).
5. В процессе амплификации (синтеза дополнительных копий ДНК) количество последовательностей кДНК в образцах многократно увеличивается.
6. К концам последовательностей кДНК присоединяются флуоресцентные или радиоактивные метки.
7. Полученные образцы в смеси с необходимыми химическими веществами через микроскопическое отверстие наносятся на ДНК-микрочипы и начинается процесс гибридизации, в ходе которого одна из цепей кДНК присоединяется к комплементарной ей цепи, имеющейся на микрочипе.
8. После окончания процесса гибридизации чипы промываются для удаления остатков материала.
9. Полученные микрочипы сканируются при помощи лазера. На выходе получается одно- или двухцветные изображения (в зависимости от количества использованных красителей).
10. На каждое изображение накладывается сетка, так, что каждой её ячейке соответствует участок чипа с пробами одного типа. Интенсивности свечения проб в ячейке сетки ставится в соответствие некоторое число, которое, в самом первом приближении, может служить мерой количества присутствовавших последовательностей РНК в соответствующем образце.

Дальнейшая обработка результатов требует многоэтапного привлечения сложного статистического аппарата.

Предобработка данных эксперимента

Корреляция между интенсивностями двух проб одного ДНК-микрочипа, представляющих один и тот же ген, обычно превышает 95%. Часто этот факт интерпретируют как подтверждение хорошей воспроизводимости экспериментов с чипами. Однако, если один и тот же биологические материал разделить на две части и сделать с ними разные микрочипы, корреляция между полученными интенсивностями, скорее всего, будет составлять от 60 до 80%. Корреляция на чипах с образцами, взятыми у мышей из одного помёта, может опускаться до 30%. Если эксперименты проводятся в разных лабораториях, корреляция между их результатами может быть ещё ниже .

Такая низкая воспроизводимость интенсивностей связана с совокупным воздействием большого количества источников вариации. Их можно разделить на три большие группы. Биологическая вариация включает неотъемлемые особенности организмов. Техническая вариация появляется на этапе выделения образцов, их окрашивания и гибридизации. Погрешность измерения связана со сканированием готовых массивов, на результаты которого может повлиять, например, пыль внутри сканера.

Нейтрализация эффектов технической вариации и ошибки измерения производится на этапе предобработки ДНК-микрочипов.

Фоновая поправка

Необходимость фоновой поправки связана с наличием таких мешающих факторов, как шум оптической системы распознавания (данные интенсивности, полученные при сканировании, не равны "настоящим" интенсивностям проб) и неспецифическая гибридизация (присоединение нуклеотидных последовательностей к зондам чужих проб).

Нормализация

Нормализация данных позволяет сделать несколько рассматриваемых в эксперименте чипов пригодными к сравнению между собой. Основная цель анализа на этом этапе - исключить влияние систематических небиологических различий между микрочипами. Источников таких различий множество: вариации эффективности обратной транскрипции, маркировки красителями, гибридизации, физические различия между чипами, небольшие различия в концентрации реагентов, вариация лабораторных условий.

Показано, что выбор метода нормализации оказывает существенное влияние на результат анализа .

Суммаризация

Обобщение значений уровня экспрессии по всем пробам, соответствующим одинаковым последовательностям

Контроль качества

Обработка выбросов

Основной этап статистической обработки

Ссылки

• DNA microarray
• DNA microarray experiment - статья из английской Википедии
• DNA Microarray Virtual Lab - пошаговый интерактивный пример эксперимента с двукрасочным ДНК-микрочипом
• Ten Pitfalls of Microarray Analysis - распространённые ошибки анализа ДНК-микрочипов