Реферат на тему:

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Электрофорез белков в простой системе удобно использовать для их разделения, но не характеристики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в простой системе зависит одновременно и от массы белка, и от его суммарного электрического заряда, и от конфигурации, и от жесткости упаковки белковой глобулы. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зависимости от условий электрофореза. Для установления строгой корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.

Электрофорез в ПААГ с использованием DDC-Na позволяет разделять белки, различающиеся между собой только по молекулярной массе. Для этого смесь белков в исходном препарате обрабатывают не менее, чем трехкратным избытком DDC-Na (по весу). За счет гидрофобных взаимодействий детергент одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг DDC-Na на 1 мг белка.

Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привносимый детергентом, в большинстве случаев делает несущественной роль собственного заряда белка. Благодаря электростатическому отталкиванию тесно расположенных отрицательно заряженных остатков серной кислоты, белковая цепь распрямляется и приобретает форму жесткой палочки с поперечником -1,6 m и длиной, зависящей только от числа звеньев этой цепи, а следовательно - от молекулярной массы белка.

Одновременно с обработкой DDC-Na необходимо обеспечить возможность полного развертывания белковой цепи, а для этого - разорвать все ковалентные S-S связи внутри молекулы белка. С этой целью белок перед электрофорезом обрабатывают еще и высокой концентрацией (1%) (3-меркаптоэтанола при повышенной температуре.

Электрофретическая подвижность, т. е. скорость миграции при напряженности поля 1 В/см, жесткого комплекса белок DDC-Na оказывается связанной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением A-BIgM, где А и В - коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину и" удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и «лидирующего красителя» - бромфенолового синего. Обозначим это отношение Rf. Такая замена отразится только на значении коэффициентов А и В, о которых нам известно только то, что они в данных условиях опыта одинаковы для всех белков. Измененные величины коэффициентов тоже будут постоянными величинами в данном опыте. Поэтому вместо их определения пользуются методом сравнения с известными по своей массе «маркерами». Одновременно с электрофорезом изучаемой смеси белков, отдельным треком на той же пластинке, т.е. в тождественных условиях эксперимента, разделяют смесь известных маркеров. С их помощью по точкам строят зависимость lgM=f(Rf), которая, естественно, оказывается прямолинейной. Опираясь на эту зависимость, можно графически, по измеренным величинам Rf определить значения lg М, а следовательно и М для исследуемого белкА. Разумеется, вся предварительная обработка детергентом и Р-меркаптоэтанолом должна быть проведена строго одинаково для этого белка и всех маркеров.

Выбор буфера в этом варианте не играет роли, так как заряд белка определяется его комплексом с DDC-Na. Обычно используют нейтральный буфер, добавляя в него 0,1% DDC-Na, чтобы поддержать комплекс детергента с белками»

Для белков с молекулярной массой менее 12 тысяч дальтон определение М становится ненадежным. Для различных диапазонов масс белков рекомендуется использовать ПААГ различной пористости, согласно следующей таблице:

Диапазон М (тысяч дальтон) % ПААГ 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5

Сам процесс электрофореза и окраски белков после его окончания производят как обычно, но DDC-Na от белка предпочтительно отмыть до окраски, вымачивая гель в 50% -ной ТХУ в течение ночи.

DDC-Na в комплексе с белком в некоторой мере препятствует окрашиванию (большой отрицательный заряд!).

Двумерный электрофорез в ПААГ

Полное разделение сложной смеси белков не всегда удается осуществить в ходе одного электрофоретического эксперимента. Всегда есть вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввиду совпадения их электрофоретических подвижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях фракционирования смеси белков имеет смысл использовать разделение в первом направлении как исходное для разделения во втором, перпендикулярном первому направлении при измененных условиях электрофореза.

Для этого трек первого направления (без осаждения и окраски белков в нем) вырезают и накладывают на стартовую зону пластинки второго направления (без карманов). Контакт между двумя гелями обеспечивают заливая место их соприкосновения расплавленным раствором агарозы в том же буфере. Электрофорез, естественно, ведут в направлении, перпендикулярном полоске. Каждая негомогенная полоса в ней может дать несколько пятен во втором направлении, если в новых условиях содержавшиеся в ней белки обретут различную электрофоретическую подвижность. В результате после осаждения и прокрашивания на пластинке появляется картина распределенных по всей поверхности пятен («фингерпринт»). Число пятен различных белков, которое удается зафиксировать на одной пластине может достигнуть нескольких сотен. На рис. 42 воспроизведена картина распределения пятен, полученных при двумерном электрофорезе белков из большой субъединицы одной из бактерий (в работе Mets, Bogorad Anal. Biochem. 57 200, 1974).

Извлечение белков из геля после электрофореза

Для целей аналитической идентификации белки из ПААГ (без осаждения и окраски) можно перенести на нитроцеллюлозный мембранный фильтр. Такие фильтры обладают способностью сорбировать основные белки. Перенос осуществляется путем вымывания белковых полос из геля током буфера в направлении, перпендикулярном поверхности пластинки. Фильтр накладывают непосредственно на влажный гель. Устройство для обеспечения тока буфера от геля к фильтру будет описано ниже в связи с электрофорезом ДНК.

В результате на фильтре получаются «реплики» белков, разделенных в геле. Для их идентификации можно использовать характерные реакции, иногда ферментативные или имунные (см. ниже), а также гибридизацию с мечеными радиоактивным фосфором ДНК или РНК, если эти белки in vivo связывались с ДНК или разделению подвергались рибосомальные белки, связывающиеся с РНК рибосом.

Главное, что с точки зрения электрофореза отличает нуклеиновые кислоты от белков - это значительный по величине суммарный отрицательный заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты в связях между нуклеозидами. рН окружающей среды мало влияет на этот заряд. Поэтому электрофорез можно вести не в буфере, а в любом подходящем ионосодержащем растворе, например в слабом растворе щелочи. Во всех случаях в жидкую среду вносят ЭДТА до концентрации 1-2 mM. Это необходимо для блокирования действия нуклеаз и предупреждения осаждения (особенно РНК) двухвалентными металлами.

Таким образом, разделение фрагментов ДНК и РНК электрофорезом приходится вести только по размеру. Однако размеры эти могут варьировать в очень широких пределах: от десятков нукле-отидных звеньев до многих сотен тысяч, а если выражать через молекулярные массы, то от нескольких тысяч до сотен миллионов дальтон.

Естественно, что для фракционирования относительно коротких фрагментов используют электрофорез в ПААГ, а для разделения высокомолекулярных ДНК, более крупнопористый носитель - агарозу. С ней мы познакомимся чуть позже. А пока в порядке связи с предыдущими параграфами уместно сделать несколько замечаний об электрофорезе ДНК в ПААГ. В нижеследующей таблице представлены рекомендации по выбору пористости геля в зависимости от размеров относительно коротких фрагментов ДНК, охарактеризованных числом пар оснований (п.о.):

В последнем диапазоне этой таблицы находятся предельные размеры ДНК, доступные автоматическому секвенированию последовательности нуклеотидов. Этот революционный метод анализа ДНК будет рассмотрен в следующей главе.

Сейчас же, прежде, чем перейти к электрофорезу в агарозе, я хочу познакомить учащихся и читателей с новыми идеями фракционирования крупных фрагментов ДНК в ПААГ с оригинальным использованием импульсов электрического напряжения, подаваемых на гель. Эти импульсы подаются поочередно в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Идея здесь заключается вот в чем. Даже очень длинная и гибкая молекула ДНК может протиснуться через относительно малые поры геля, если она вытянута в направлении продвижения к «основному» аноду, скажем, расположенному внизу пластинки. Напряжение на этот анод подается не постоянно, а импульсами. Второй, «вспомогательный» анод создает напряженность электрического поля, перпендикулярную основному направлению движения ДНК к низу пластинки. Напряжение на него подается тоже достаточно мощными, но более короткими импульсами, чем на основной анод, чередуясь с ними.

Назначение «перпендикулярного» электрического поля состоит в том, чтобы поворачивать длинные молекулы больших ДНК так, чтобы в момент подачи «продольного» импульса они находились в положении, благоприятном для движения вдоль пластинки вниз, к основному аноду. Чем длиннее цепи ДНК, тем медленнее они будут менять свою ориентировку и потому медленнее подвигаться в нужном направлении. Авторы метода утверждают, что таким образом в ПААГ им удавалось разделять фрагменты ДНК длиной до пяти миллионов пар оснований.

Гели агарозы

Агароза - это особо чистая фракция природного, линейного полисахарида, агара, выделяемого из морских водорослей. Мы с ним уже встречались.

Молекулярная масса одиночных нитей агарозы лежит в пределах 10-100 тысяч дальтон. Агароза для электрофореза поставляется в виде лиофилизированного (высушенного в вакууме) порошка. Гелеобразование происходит при остывании даже очень разбавленного горячего раствора агарозы в буфере. При температуре 84-96° С (а у некоторых типов агарозы уже при 70°) нити полимера плавятся и образуют с окружающей водной средой однородную прозрачную жидкость. Она обладает ярко выраженным температурным гистерезисом - застывает при температуре порядка 40°С. Остывая до этой температуры, даже 0,4% -ные растворы агарозы образуют прочные гели. У легкоплавких типов агарозы температура затвердевания снижается до 30°. Такая особенность агарозы облегчает все манипуляции с ее растворами, не опасаясь их затвердевания. Более того, расплавленную на кипящей бане взвесь агарозы в воде охлаждают до 50-55° и только при этой температуре добавляют концентрат буфера и все другие добавки, а затем заливают в форму для электрофореза. Это удобно и не связано с возникновением тепловых деформаций.

Остывая, хаотически ориентированные нити затвердевшей агарозы благодаря множественным водородным связям между нитями собираются в жгуты. Эти жгуты свободно перекрещиваясь, создают в окружающей их жидкости очень крупнопористую и, вместе с тем, жесткую пространственную сетку.

Размер пор геля агарозы, естественно, связан с концентрацией ее исходного раствора. Можно привести некоторые рекомендации по выбору этой концентрации, почерпнутые из опыта электрофореза нуклеиновых кислот:

Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид 0,4-0,5%.

Для рестриктов ДНК, содержащих 5-20 тысяч пар оснований 0,7-0,8%.

Для более коротких рестриктов ДНК и двунитевых РНК рео-вируса 1,5%.

Для рибосомальных РНК - 1,75%.

Для иРНК и рестриктов ДНК до 1000 п.о. - 2% .

Приготовление пластины для электрофореза в агарозе очень просто. Нужного размера стекло оклеивают со всех сторон по ребру сплошной липкой лентой так, чтобы ее верхний край на несколько миллиметров выступал над поверхностью стекла. Последнее кладут на строго горизонтальный столик. Прямо на стекло выливают рассчитанный объем еще жидкого раствора агарозы. Затем в него близ одного края стекла устанавливают гребенку, подобную той, которую ставят в форму ПААГ перед его полимеризацией. Только на этот раз гребенку погружают в агарозу перпендикулярно стеклу (зубцы ее, однако, не должны касаться стекла). После застывания агарозы гребенку вынимают, образуя таким образом «колодцы» для препаратов. Электрофорез ведут в горизонтальном положении (в треках), накладывая фитили, идущие от резервуаров с буферами. Рабочее значение напряженности поля 2-5 В/см.

ДНК, особенно двунитевые, а также и РНК хорошо окрашиваются желтым флюоресцентным красителем - бромистым эти-дием. Этот краситель несет положительный заряд, что позволяет ему взаимодействовать с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Кроме того он способен интеркалировать (встраиваться) между оснований двунитевой ДНК, что приводит к резкому усилению его флюоресценции при освещении ультрафиолетовым светом. Окраску можно производить и после электрофореза вымачиванием геля в течение 0,5-1 часа в водном растворе красителя (1 мкг/мл) или же вводить его непосредственно в гель. В последнем случае можно следить за движением полос в геле. Стеклянную пластину в этом случае освещают УФ-лампой снизу. Чувствительность окраски высока. Можно наблюдать и фотографировать полосы, содержащие 0,01 мкгДНК.

В конце электрофореза ДНК можно зафиксировать в геле осаждением из раствора, вымачивая гель в 70% -ном этаноле.

Пипетки

Конечно, современные микропипетки совсем не похожи на те, которые употребляют в школьном химическом кабинете. Их устройство таково. Довольно объемистую, пластмассовую (снаружи) рукоятку пипетки удобно держать четырьмя пальцами руки, оставив большой палец свободным для нажатия кнопки, торчащей из верхнего конца рукоятки. Книзу из нее выходит длинный, слегка конический металлический стержень, на конец которого плотно надевается конический полый наконечник из специальной пластмассы.

В рукоятке спрятан механизм, главную часть которого составляют очень точно подогнанные друг к другу тонкий цилиндр и поршень, отжимаемый кверху пружиной. Нажатием кнопки поршень перемещается вниз. Опустив наконечник в жидкость и освободив предварительно нажатую кнопку набирают в наконечник объем в 1, 2, 3 и более микролитров - в соответствии с калибровкой пипетки. Вторичным нажатием кнопки жидкость из наконечника полностью выталкивается. Наконечники поставляются стерилизованными и используются однократно.

Есть пипетки с возможностью предварительной регулировки объема жидкости, например, от 2-х до 20-ти микролитров. Регулировку осуществляют поворотом головки винта, который устанавливает длину хода поршня. Выбранный объем указывает связанный с винтом градуированный барабанчик.

Влияние вторичной структуры ДНК

В электрофоретическом поведении однонитевых (денатурированная ДНК, РНК) и двунитевых молекул нуклеиновых кислот многое определяется их размерами. В случае коротких полинуклеотидных цепей их нативная двунитевая молекула имеет более жесткую структуру, чем таких же размеров однонитевая молекула. Она труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля. В силу этого относительно короткие двунитевые фрагменты ДНК будут отставать при электрофорезе в ПААГ от денатурированных ДНК такой же длины. Такая ситуация будет иметь место даже для ДНК бактериофага ФХ-174 с молекулярной массой в 3,5 миллиона дальтон. Однако для более крупных молекул ситуация может измениться на противоположную. Длинная двунитевая цепочка оказывается уже достаточно гибкой: она продвигается через поры геля как бы «извиваясь ужом». Между тем однонитевая цепь той же длины сворачивается в рыхлый «хаотический клубок» такого размера, что его продвижение в геле оказывается более затрудненным. Денатурированная ДНК в этом случае при электрофорезе отстает от нативной. Естественно, что граница обращения описанного эффекта зависит от размеров пор геля.

Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий имеют структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца - «сверхскрученное» (ему отвечает минимум внутренних напряжений). Кольцо в целом сворачивается в «жгут», что сильно увеличивает его компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух скрученных нитей кольца появляется единичный разрыв сахаро-фосфатной цепи, то жгут разворачивается и под действием сил электростатистического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы уменьшается, ее наружные размеры увеличиваются (форма II). Что касается линейной двухните-вой молекулы ДНК (форма III), то в зависимости от среднего размера пор геля она может мигрировать быстрее или медленнее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней массы. Для крупнопористого геля решающим фактором может оказаться компактность формы I; для более мелких пор на первый план выступает большая гибкость линейной молекулы ДНК (форма III).

Скорость миграции линейных двухнитевых молекул ДНК уменьшается с увеличением их массы, но лишь до определенного предела. При молекулярной массе более 5 миллионов в 1,6%-ном геле агарозы и при массе более 12 миллионов дальтон в 0,8% -ной агарозе молекулы мигрируют практически с одинаковой скоростью, независимо от их массы. В этих случаях решающую роль играет гибкость - способность очень длинных молекул, извиваясь, проходить через гель одинаково легко (или одинаково трудно) при любой длине.

Рибосомальные РНК могут иметь существенно более невыгодную для миграции в геле вторичную структуру, чем ДНК. Дело в том, что у крупных молекул РНК эта структура представлена многочисленными, торчащими во все стороны «шпильками». Это - места локального спаривания в жесткие двунитевые структуры отдельных, зачастую далеко отстоящих друг от друга по основной последовательности, комплементарных участков РНК. Такая молекула уже не может продвигаться через поры геля Собирая основной «сэндвич» (гель, фильтр и облегающие их листки фильтровальной бумаги) следует проверять, что между ними не остаются пузырьки воздуха.

Перенос ДНК на нитроцеллюлозный фильтр занимает 2-3 часа. Следует заметить, что короткие фрагменты ДНК на нитроцел-люлозном фильтре задерживаются плохо. Если это существенно, то лучше использовать фильтры из так называемой, «диазобума-ги» или «ДБМ-бумаги». Фирма Ватман выпускает ее под наименованием «Whatman 540».

Литература

1 Курашвили Л.В. Нарушения, липидного обмена при состояниях напряжения. II Захарьинские чтения. Тезисы докладов. - 1995. -С.127.

2 Курашвили Л.В. Активность липазы и ЛХАТ при длительном обезвоживании. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. - Пенза, 1995. -С.71-72.

3 Курашвили Л.В. Фосфолипидный статус при нарушении водно-электролитного обмена. В кн.: Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Тезисы докладов. - Пенза, 1995.-С.69-70.

После экстракции смеси белков из биологического материала проводят ее разделение на индивидуальные фракции белков. Разработано несколько методов фракционирования белков, основанных на различных физико-химических свойствах белков.

– осаждение белков в изоэлектрической точке – в основе метода лежит свойство белков в изоэлектрической точке выпадать в осадок вследствие нейтрализации заряда белковой молекулы. Для каждого белка значение изоэлектрической точки строго индивидуально, поэтому данным методом возможно выделение индивидуальных белков (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).

– фракционирование белков методом высаливания – основано на различной растворимости белков в концентрированных растворах нейтральных солей, в зависимости от молекулярной массы (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).

– метод электрофоретического разделения белков на фракции – описан в разделе физико-химические свойства белков.

Кроме представленных выше методов для разделения белков на фракции широко используют хроматографические методы . Чаще всего используют колоночную хроматографию.

Особенностью данного метода является то, что смесь молекул различных белков и пептидов пропускают через колонку, содержащую твердый пористый материал (матрикс). В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями в пробирки.

Выделяют три основных вида колоночной хроматографии:

– ионообменная – для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров, например, диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза), содержащую катионные группы (отрицательный заряд) или содержащую карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлоза), содержащую аминные группы (положительный заряд):

Прочность связывания белков с ДЭАЭ-целлюлозой тем выше, чем больше в молекуле белка карбоксильных групп. Белки, адсорбированные на ДЭАЭ-целлюлозе, можно смыть (элюировать) из колонки растворами с возрастающей концентрацией хлорида натрия. Вначале элюируются слабосвязанные белки, а по мере увеличения концентрации соли и другие белки, в порядке возрастания их сродства к ДЭАЭ-целлюлозе.

Аналогично применяют и КМ-целлюлозу, но сродство белков к ней прямо пропорционально числу аминогрупп в молекуле белка.

Для снятия связанного белка также изменяют рН элюента.

– хроматография гель-фильтрацией – имеет второе название «метод молекулярных сит». В качестве сит используют сефадекс (полисахарид декстран, обработанный эпихлоридгидрином). Зерна сефадекса набухают в воде и образуют гель. Набухшие гранулы имеют поры определенного диаметра.

Разделение основано на том, что зерна сефадекса (поры гранул) непроницаемы или ограничено проницаемы для веществ с большой молекулярной массой, а небольшие молекулы свободно диффундируют (проникают) в поры зерен.

Гелеобразную массу набухшего сефадекса помещают в стеклянную колонку (трубку), на поверхности геля наносят слой белкового раствора (рис. 12, а) и затем через колонку пропускают буферный раствор (элюирующая жидкость). Белки проходят вдоль колонки между гранулами тем медленнее, чем меньше их молекулярная масса, так как молекулы белков с еще меньшей молекулярной массой легче диффундируют внутрь гранул (в поры) (рис. 12).

Рис. 12. Фракционирование белков методом гель-фильтрации

Белки вымываются (элюируются) из колонки в порядке убывания молекулярной массы. Следовательно, первыми элюируются крупные белковые молекулы (рис. 12, б), которые не диффундируют в зерна, затем мелкие молекулы и в последнюю очередь низкомолекулярные примеси.

Этот метод применяют не только для фракционирования белков по молекулярной массе, но и для очистки их от низкомолекулярных примесей.

– аффинная хроматография – или хроматография по сродству. Принцип метода заключается в том, что происходит избирательное взаимодействие белков со специфическими веществами – лигандами, закрепленными на носителях (рис. 13).

В качестве носителя используют активированную бромцианом сефарозу. К сефарозе присоединяют лиганды различного происхождения – субстрат, или антиген, или рецептор, которые будут афинно связывать только один белок из смеси:

– субстрат → фермент;

– антиген → антитело;

– гормон → рецептор данного гормона.

Другие белки, не связавшиеся с лигандом, удаляются путем промывания колонки.

Рис. 13. Механизм аффинной хроматографии

Снятие с колонки афинно закрепленного белка осуществляется с помощью буферного раствора (элюента). В состав буфера вводят детергент, который ослабляет связи между белком и лигандом, или через колонку пропускают раствор с высокой концентрацией свободного лиганда. В этом случае белок легче связывается со свободным лигандом и вымывается (элюируется) из колонки.

Разделение белков (фракционирование).

Для разделения белков часто используют хроматографические методы , основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ с помощью тока элюирующей (вымывающей) жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам. При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона с разделяемой смесью. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс , агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".

Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул (рис. 1).

Рисунок 1. Разделение смеси белков методом гель-фильтрации.

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCl, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству . Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 2). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Рисунок 2. Аффинная хроматография.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Ультрацентрифугирование. Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой (рис. 3). После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Рисунок 3. Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α 1 глобулины, α 2 -глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 4). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Рисунок 4. Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.

Отделение белков от низкомолекулярных примесей

Метод мембранных сит (диализ)

Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом белки отмывают от примесей.

Разделение белков по молекулярной массе

Гель-хроматография

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Ультрацентрифугирование

Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия).

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.

Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие.

Методом электрофореза можно разделить белки по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na).

ДДС-Na является дифильным веществом и содержит заряженную группу и гидрофобную. Белки связываются с ДДС-Na своими гидрофобными радикалами и при этом денатурируют. Таким образом, белки выравниваются по форме и заряду. После этого подвижность белка при электрофорезе зависит только от его молекулярной массы.

Исследование однородности белковых препаратов и выделение отдельных белковых фракций производится с помощью различных методов, наиболее важные из которых основаны на применении ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, а также на изучении растворимости белков.

1. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях веществ в молекулярной массе:

а) ультрацентрифугирование. В ультрацентрифуге сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем менее тяжелые.

б) гель-фильтрация. При этом методе хроматографическая колонка заполняется пористыми гранулами сильно гидратированного углеводного полимера, чаще всего сефадекса (специальным образом обработанные производные высокомолекулярного углевода декстрана). При фильтровании через такую колонку смеси низкомолекулярных и высокомолекулярных белков небольшие белковые молекулы, проникая через поры внутрь гранул сефадекса, будут протекать по колонке медленнее, чем белки, молекулы которых не помещаются в порах гранул и поэтому быстрее вытекают из колонки.

2. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях в их кислотно-основных свойствах (или различия их электрических зарядов):

а) метод электрофореза. Смысл электрофореза заключается в разделении находящихся в растворе веществ в электрическом поле на основе различий их электрических зарядов. Электрофоретическое исследование белка производят обычно при нескольких значениях рН, т.к. установлено, что если при одном рН препарат белка ведет себя как однородное вещество, то при другом рН этот же препарат может быть неоднородным.

За последние годы широкое распространение получил электрофорез растворов белков и пептидов на различных носителях – фильтровальной бумаге, целлюлозном или крахмальном порошке, полиакриламидном геле. Эти методы позволяют анализировать чрезвычайно малые количества белков.

б) диск-электрофорез в полиакриламидном геле, при котором смесь белков подвергается одновременному воздействию электрического поля и градиента рН. Он обладает особенно высокой разрешающей способностью.

Фильтрование через гель, так же как и электрофорез в полиакриламидном геле, широко применяется для быстрого приблизительного определения молекулярной массы белков.

в) ионообменная хроматография. В ионообменной хроматографии в качестве носителя используются полимеры, несущие на себе заряд – ионообменные смолы:

· катионообменные смолы (заряженные отрицательно) – обмениваются катионами;

· анионообменные смолы (заряженные положительно) – обмениваются анионами.

Например, часто используется катионообменная полистероидная сульфированная смола. Если раствор аминокислот имеет кислую среду, при загрузке колонки положительно заряженные аминокислоты и белки вытесняют натрий и соединяются с сульфид-анионом. При добавлении гидрооксида натрия рН увеличивается; когда рН достигнет значения, равного изоэлектрической точке молекулы белка, аминокислоты теряют заряд и становятся нейтральными. Под действием силы тяжести аминокислота выходит из колонки, потеряв заряд. Разные белки (аминокислоты) имеют разные значения изоэлектрических точек.

3. Методы разделения, основанные на различиях в веществ по растворимости:

а) метод фракционирования белков солевыми растворами. Основан на том, что каждый индивидуальный белок разделяемой смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора под действием соли называется высаливанием. При дальнейшем насыщении солью выпадает следующий индивидуальный белок и, таким образом, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки.

б) распределительная хроматография на бумаге. Этот метод основан на различной степени распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (подвижной и неподвижной) и заключается в том, что каплю гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, один конец которой опускают в органический растворитель. Растворитель под действием капиллярных сил всасывается бумагой и, проходя по полоске бумаги, увлекает за собой аминокислоты.

Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от их химического строения и способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителях. В качестве подвижного растворителя используют водонасыщенный фенол, n-бутиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают бумагу. Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость, например, в феноле, тем быстрее они движутся вслед за фронтом органического растворителя.

4. Определение первичной структуры белка

Наиболее ответственной процедурой при установлении первичной структуры белков является определение последовательности аминокислотных остатков. В настоящее время эту работу ведут преимущественно либо фенилизотиоцианатным методом Эдмана.

Метод Эдмана реализуется в специально созданном для этой цели приборе, получившем название секвенатор (от sequence – последовательность). Метод Эдмана сводится к обработке фенилизотиоцианатом белка или пептида, присоединенного через С-концевую аминокислоту к инертному носителю (полистиролу или пористому стеклу) в колонке секвенатора. После промывки колонки растворителями (метанол, дихлорэтан) образовавшийся фенилтиокарбамилпептид подвергают воздействию безводной трифторуксусной кислоты, в результате чего высвобождается анилинотиозолинон и в его составе N-концевая аминокислота, а укороченный на один аминокислотный остаток пептид или белок остается связанным с носителем.

Раздел 3. НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Лекция 4. Строение и функции нуклеотидов

1. Общая характеристика нуклеотидов

Нуклеотиды – сложные органические вещества, состоящие из 3-х обязательных компонентов:

1) азотистого основания;

2) пятиуглеродного сахара;

3) остатка фосфорной кислоты.

Сложные органические соединения, состоящие только из азотистого основания и сахара-пентозы, называются нуклеозидами. Следовательно, нуклеотиды – фосфорнокислые эфиры нуклеозидов.

Азотистые основания

Азотистые основания являются производными двух гетероциклических соединений – пурина и пиримидина:

· пуриновые азотистые основания:

Аденин Гуанин

· пиримидиновые азотистые основания:

Урацил Цитозин Тимин

Пятиуглеродные сахара:

β-рибоза β-дезоксирибоза

Фосфорная кислота

В состав нуклеотидов обязательно входит остаток фосфорной (ортофосфорной) кислоты.

Помимо указанных выше трех обязательных компонентов, в состав молекул нуклеотидов могут входит и другие функциональные группы.

При образовании нуклеозидов первый атом рибозы (дезоксирибозы) связывается с N-1 атомом пиримидинового или N-9 атомом пуринового основания.

С рибозой соединяются аденин, образуя аденозин; гуанин, образуя гуанозин; цитозин, образуя цитидин; урацил, образуя уридин.

С дезоксирибозой соединяются аденин, гуанин, цитозин и тимин, образуя соответственно дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин, тимидин.

Наиболее распространено в природе присоединение по 5 положению сахара и оно не указывается.

В организме нуклеотиды являются мономерами нуклеиновых кислот, либо функционируют самостоятельно. В зависимости от того, в каком количестве в нуклеотидах представлены их основные компоненты, все нуклеотиды подразделяют на мононуклеотиды, динуклеотиды и полинуклеотиды (полинуклеиновые кислоты).

2. Строение и функции моно- и динуклеотидов

Моно- и динуклеотиды не входят в состав нуклеиновых кислот; они функционируют самостоятельно. В состав самостоятельных нуклеотидов в качестве сахара всегда входит рибоза.

К мононуклеотидам относятся АТФ, АДФ, АМФ, коэнзим А и другие нуклеотиды.

АТФ – аденозинтрифосфорная кислота:

АТФ – энергетический эквивалент клетки, она является посредником между реакциями, идущими с выделением энергии (экзергоническими) и реакциями, идущими с поглощением энергии (эндергоническими). Иными словами, в форме АТФ клеткой запасается энергия, которая затем используется для процессов жизнедеятельности.

Химические связи между различными атомами в органических соединениях делятся на 2 типа:

1) нормальные

2) макроэргические

Нормальные связи – связи, при возникновении или распаде которых изменение уровня свободной энергии соединений составляет 12,5 Дж/моль.

Макроэргические связи – связи, при возникновении или распаде которых уровень свободной энергии соединения составляет 25-50 кДж/моль вещества.

Понятие «макроэргическая связь» учитывает энергетический эффект преобразованной связи посредством химической реакции вещества с нормальными свойствами.

Связи между остатками фосфорной кислоты являются макроэргическими – при их гидролизе выделяется энергия. Такие связи принято обозначать волнистой черточкой.

Энергия 1-й молекулы АТФ может служить только для 1-й реакции. АДФ и АМФ – не способны быть источником энергии.

В живых клетках имеются 3 способа образования АТФ:

1) Субстратное фосфорилирование.

2) Окислительное фосфорилирование.

3) Фотосинтетическое фосфорилирование.

Коэнзим А (КоА) . КоА является переносчиком ацильных групп; участвует во многих процессах. В его состав входит аденин, рибоза, пирофосфат, пантотеновая кислота (витамин В 3) и тиоламин. Упрощенно коэнзим А представляют в виде следующей формулы: HS-KoA. При взаимодействии коэнзима А с уксусной кислотой образуется ацетилкоэнзим А, в молекуле которого появляется макроэргическая (высокоэнергетическая):

Ацетилкоэнзим А

Ацетилкоэнзим А является ключевым метаболитом, благодаря которому осуществляется не только распад и синтез различных веществ, но и взаимосвязь между процессами обмена белков, липидов и углеводов.

К динуклеотидам относятся НАД, НАДФ, ФАД и др.

НАД – никотинамидадениндинуклеотид;

НАДФ – никотинамидаденин динуклеотид фосфат.

В состав этих динуклеотидов входит никотинамид (амид никотиновой кислоты, являющееся важным витамином - витамином В 5). Молекула НАДФ идентична по структуре НАД с той лишь разницей, что у НАДФ у С-3 атома рибозы ОН-группа замещена остатком молекулы фосфорной кислоты.

Молекулы НАД и НФДФ способны к обратимому окислению и восстановлению (благодаря окислительно-восстановительной способности никотинамида), поэтому они участвуют в качестве переносчиков водорода; в реакциях биологического окисления НАД и НАДФ являются кофакторами ферментов дегидрогеназ.

Структура НАД (окисленная форма)

ФАД – флавинадениндинуклеотид. В его состав входит рибофлавин (витамин В 2).

Структура ФАД (окисленная форма)

ФАД, как и другие динуклеотиды, способен обратимо окисляться и восстанавливаться, присоединяя к своей молекуле 2 атома водорода, поэтому он участвует в биологическом окислении в качестве переносчика водорода. Является кофактором дегидрогеназ, так же, как и НАД и НАДФ.

3. Строение и функции нуклеиновых кислот

Самое замечательное свойство живых клеток – их способность воспроизводить себе подобных с почти предельной точностью и не один-два раза, а в сотнях и тысячах генераций.

Живые клетки обладают такой способностью благодаря наличию в них нуклеиновых кислот.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;

РНК – рибонуклеиновая кислота.

ДНК и РНК – высокомолекулярные соединения, которые построены на основе нуклеотидов, соединенных 3, 5 - фосфодиэфирными связями. Их молекулярная масса сильно варьирует (от 15 тыс. до 1 млрд).

Нуклеиновые кислоты хорошо растворяются в фенолах; плохо – в слабых растворах кислот.

Различия между ДНК и РНК:

1. В составе ДНК – аденин, гуанин, цитозин, тимин;

в составе РНК – аденин, гуанин, цитозин, урацил.

2. В составе ДНК – дезоксирибоза; в составе РНК – рибоза.

3. Молекулы ДНК двухцепочечные; РНК – одноцепочечные.

Особенности структуры ДНК

· ДНК состоит из двух правозакрученных полинуклеотидных спиралей, имеющих общую ось.

· Две цепи ДНК антипараллельны, т.е. 3 и 5 фосфодиэфирные мостики ориентированы в противоположных направлениях.

· Основания плоские, гидрофобные, расположены в параллельных плоскостях и перпендикулярно длинной оси спиралей.

· Основания 2-х цепей спарены. Напротив А-Т; напротив Г-Ц;

Спаренные основания являются комплементарными по отношению друг к другу.

Комплементарность – пространственная взаимодополняемость поверхностей взаимодействующих молекул или их частей, приводящая к возникновению между ними вторичных связей.

Между А и Т возникает 2 водородные связи; между Г и Ц – 3 водородные связи.

Остатки сахаров и фосфорные группы остаются на поверхности молекулы и контактируют с водой. Отрицательно заряженные группы остатков фосфорной кислоты легко вступают во взаимодействие с белками, среди которых преобладают гистоны – белки, отличающиеся своей основной природой.

4. Нуклеиновые кислоты отличаются друг от друга по функциям.

Функции ДНК – хранение, репликация (удвоение) и передача наследственной информации (наследственная информация – это информация о первичной структуре белков).

Функции РНК определяются типом РНК.

Типы РНК:

а) м-РНК – матричная или и-РНК – информационная.

Матричная РНК выполняет функцию переноса наследственной информации из ядра клетки от ДНК в цитоплазму, к месту синтеза белка.

Реализация наследственной информации – синтез белка.

Существуют сотни тысяч видов м-РНК в клетке.

б) т-РНК – транспортная.

Переносит к месту синтеза белка необходимые аминокислоты.

в) р-РНК – рибосомальная.

Рибосомы – органоиды, выполняющие функции синтеза белка.

5. Нуклеиновые кислоты отличаются по локализации.

Основное количество ДНК находится в ядре клетки (в составе хромосом). Часть ДНК располагается в митохондриях и хлоропластах (ее называют цитоплазматической ДНК). РНК находится в цитоплазме.

4. Основные биохимические функции нуклеотидов

Таким образом, нуклеотиды объединяют группу веществ, которые выполняют самые разнообразные функции:

1. Являются строительными блоками нуклеиновых кислот, участвуют в молекулярных механизмах, с помощью которых генетическая информация хранится, реплицируется и транскрибируется.

2. Выполняют важную роль в энергетическом (фосфорном) обмене, в аккумулировании и переносе энергии.

3. Служат кофакторами ферментов, относящихся к различным классам.

4. Играют важную роль в синтезе и распаде углеводов, жирных кислот и липидов.

5. Некоторые нуклеотиды являются посредниками в сложных процессах сигнальной трансдукции (передачи сигналов в живых клетках).

Раздел 4. ФЕРМЕНТЫ

Лекция 5. Строение, механизм действия и классификация ферментов

1. Строение и основные свойства ферментов

Ферменты (энзимы) – вещества белковой природы, присутствующие во всех живых клетках и выполняющие роль катализаторов биохимических процессов.

По своему составу ферменты делятся на:

1) простые – состоят только из аминокислот;

2) сложные – состоят из 2-х частей:

Из белковой, которая называется апоферментом и

Небелковой части – кофактора.

Комплекс апофермента и кофактора называется холоферментом.

Ни апофермент, ни кофактор по отдельности не способны катализировать реакцию. Функционально активен только их комплекс.

Виды кофакторов:

По своей химической природе кофакторы могут быть представлены как органическими, так и неорганическими соединениями.

Органические кофакторы можно разделить на две группы:

1) простетические группы – кофакторы, которые прочно соединены с апоферментом и при выделении из организма не отсоединяются от белковой части.

Например, ФАД в составе фермента сукцинатдегидрогеназы из цикла Кребса.

2) коферменты – кофакторы, которые соединены с апоферментами слабыми связями и легко от него отщепляются: например, НАД, НАДФ, а иногда и ФАД.

Неорганические кофакторы представлены ионами металлов (чаще всего ионами железа, меди, марганца, цинка и т.д.). Ионы металлов как кофакторы либо непосредственно участвуют в акте катализа, либо образуют мостики, связывающие фермент с субстратом.

Субстрат (S) – вещество, химические превращения которого катализирует фермент.

Строение фермента, или энзима (Е):

Поскольку молекулы субстрата обычно мельче молекул ферментов, то в непосредственный контакт с субстратом вступает только часть молекулы фермента – активный центр. Причем, геометрическая форма поверхности участка молекулы субстрата является комплементарной поверхности активного центра.

Активный центр фермента – уникальная комбинация аминокислотных остатков, обеспечивающая взаимодействие с молекулой субстрата и участвующая в акте катализа. У сложных ферментов в состав активного центра обязательно входит кофактор.

Активный центр может иметь 2 участка:

· якорный (субстратный);

· каталитический.

Якорный участок обладает геометрическим сходством (соответствием) молекулы субстрата и обеспечивает специфичность действия фермента.

Сходство между ферментами и небиологическими катализаторами

1. Любой катализатор (неорганический и органический) уменьшает энергию активации молекулы. Энергия активации – количество энергии в калориях, необходимая для перевода всех молекул 1-го моля вещества в активированное состояние, т.е. состояние, при котором они способны вступить в химическую реакцию.

2. Любой катализатор может ускорять только химические реакции, возможные с точки зрения термодинамики.

3. Катализаторы не изменяют направление химической реакции.

4. Катализаторы не расходуются в процессе реакции.

Отличия ферментов от неорганических катализаторов

1. Катализ осуществляется в очень мягких условиях (Т, рН)

2. Высокая эффективность: ферменты увеличивают скорость реакции

в 10 10 - 10 12 раз.

Пример: в организме есть фермент каталаза (кофактор - Fe).

1 мг железа в каталазе действует как 10 т неорганического железа.

3. Специфичность действия. Каждый фермент ускоряет только 1 реакцию. Виды специфичности:

Абсолютная (1 фермент действует только на 1 субстрат, например, фермент уреаза катализирует гидролиз мочевины);

Относительная (1 фермент может действовать на группу сходных по строению субстратов).

4. Возможность тонкой и точной регуляции скорости реакции изменением условий среды (связано с белковой природой фермента)

Для каждого фермента есть свой температурный оптимум.

Пример: температура тела – 36,6 град.; при Т=40-41град. может быть необратимая денатурация. При низких температурах наблюдается снижение скорости ферментативного катализа (из-за броуновского движения молекул).

Ферменты очень чувствительны к изменению кислотности среды, в которой они действуют. Активность фермента проявляется в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимумом рН. Можно считать, что для каждого фермента имеется определенная оптимальная концентрация протонов, при которой он наиболее активен.

Изменение рН приводит к изменению зарядов на активном центре и на молекуле в целом; в результате этого изменяется конформация белковой молекулы, вследствие чего нарушается пространственное соответствие активного центра и субстрата, а значит, скорость реакции снижается.

5. Возможность насыщения фермента субстратом (особенности кинетики).

6. Ферментативный катализ – это строго запрограммированный процесс (1 реакция; 1 субстрат; 1 фермент) – серия элементарных превращений вещества, строго организованных в пространстве и времени.

2. Механизм действия ферментов

Действие фермента основано на образовании фермент-субстратного комплекса. Под действием субстрата изменяется конформация фермента, затем изменяется субстрат.

Механизм действия ферментов можно представить в виде следующей схемы:

E+S → ES → EZ → EP → E+P

Можно выделить 4 фазы:

1. Между субстратом и ферментом возникают соединения (ES), в которых соединения связаны ионной, ковалентной или другой связью.

2. Субстрат под действием присоединенного фермента претерпевает изменения (S→Z), делающие его более доступным для соответствующей реакции.

3. Происходит химическая реакция с образованием фермент-продуктного комплекса (EP).

4. Продукты реакции высвобождаются из фермент-продуктного комплекса.

3. Номенклатура и классификация ферментов

Номенклатура ферментов (правила образования их названий)

1. Случайная (по случайным признакам) – тривиальная

Пример: папаин (carica papaja – из дерева).

2. Рациональная: субстрат +”аза” (липиды – липаза)

3. Систематическая: субстрат + тип катализируемой реакции + «аза» (лактатдегидрогеназа), либо субстрат + название класса, к которому относится данный фермент+ «аза» (лактат-оксидоредуктаза).

Классификация ферментов

Принята в 1961 году.

В основу классификации положен тип катализируемой реакции:

1. Оксидоредуктазы (сложные ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции). Пример: изоцитратдегидрогеназа из цикла Кребса.

2. Трансферазы (катализируют реакции переноса функциональных групп или молекулярных остатков между молекулами). Пример: киназы – трансферазы 1-й стадии гликолиза.

3. Гидролазы (простые ферменты, катализируют реакции гидролиза крахмала, олигосахаридов, жиров). Примеры: липаза, инвертаза, мальтаза и др.

4. Лиазы (катализируют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи, либо присоединением по двойной связи). Пример: альдолаза из гликолиза.

5. Изомеразы (катализируют реакции изомеризации – пространственной или структурной перестройки в пределах 1-й молекулы). Пример: триозофосфатизомераза из гликолиза.

6. Лигазы (часто называются синтетазами) – катализируют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энергией связей (АТФ).

Каждый фермент имеет 4-х-значный шифр: класс-подкласс-подподкласс- индивидуальный номер фермента.

4. Кинетика ферментативных реакций

Особенностью кинетики ферментативной реакции является насыщение фермента субстратом, при котором дальнейшее увеличение [S] не приводит к увеличению скорости реакции. Эмпирическим путем установлено, что кинетика ферментативной реакции может быть выражена следующим графиком:

Концентрация субстрата, при которой фермент достигает насыщения, является постоянной характеристикой для каждого конкретного фермента.

Кинетику ферментативной реакции можно описать с помощью уравнения, которое было выведено теоретическим путем учеными Михаэлисом и Ментен, и именно в честь них было названо.

Уравнение Михаэлиса - Ментен

К м – константа Михаэлиса. Это такая концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Константа Михаэлиса характеризует сродство фермента к субстрату: чем меньше эта константа, тем больше сродство фермента к субстрату, тем эффективнее реакция.

5. Регуляция ферментативных процессов в клетке

Многочисленные способы регуляции ферментативных процессов можно разделить на две группы:

1. Регуляция содержания фермента за счет изменения скорости его синтеза и распада. Следует отметить следующие процессы:

репрессия – процесс подавления (или снижения) скорости синтеза фермента;

индукция – процесс ускорения синтеза ферментов под действием специфических низкомолекулярных соединений – индукторов.

2. Регуляция активности имеющихся в клетке ферментов.

а) путем изменения температуры, значения рН, количества субстрата, кофакторов и т.д.;

б) аллостерическая регуляция (характерна только для аллостерических ферментов). Аллостерическими называют ферменты, имеющие кроме активного центра дополнительный центр связывания (аллостерический центр). Активность аллостерических ферментов регулируется путем изменения конформации молекул ферментов, вызванного присоединением специального метаболита к аллостерическому центу. Метаболит-регулятор (аллостерический эффектор) выполняет функции либо активатора, либо ингибитора;

в) ковалентная модификация ферментов – регуляция каталитической активности ферментов может осуществляться за счет ковалентного присоединения фосфатной группы или нуклеотида. Например, фосфорилированная форма гликогенфосфорилазы обладает более высокой каталитической активностью;

г) изменение активности ферментов с помощью активаторов – химических соединений, повышающих активность ферментов (например, аминокислота цистеин и трипептид глутатион активируют действие многих протеаз).

д) изменение активности ферментов с помощью ингибиторов – химических соединений, подавляющих активность ферментов.

Ингибирование

Ингибирование – снижение или полное подавление активности ферментов под действием определенных веществ (ингибиторов).

Ингибирование может быть двух основных видов: небратимое и обратимое.

При необратимом ингибировании фермент и ингибитор образуют недиссоциирующий комплекс. Необратимое ингибирование в организме встречается редко и если оно есть, то из-за веществ, поступающих извне.

При обратимом ингибировании фермент и ингибитор образуют диссоциирующий комплекс.

Обратимое ингибирование, в свою очередь, делится на конкурентное и неконкурентное.

Конкурентное ингибирование – ингибирование, при котором субстрат и ингибитор обладают сходным строением и конкурируют за активный цент фермента. Конкурентное ингибирование в организме часто встречается и является способом регулирования активности фермента.

Скорость реакции при конкурентном ингибировании зависит от соотношения концентраций субстрата и ингибитора. Чем выше концентрация субстрата, тем выше вероятность формирования комплекса, тем выше скорость реакции. Таким образом, конкурентное ингибирование можно подавить путем увеличения концентрации субстрата.

Неконкурентное ингибирование – ингибирование, при котором субстрат и ингибитор взаимодействуют с разными частями молекулы фермента. При этом ингибитор, соединяясь с молекулой фермента, так модифицирует его структуру, что достижение максимальной скорости реакции невозможно.

При неконкурентном ингибировании увеличение концентрации субстрата не приводит к устранению действия ингибитора. Неконкурентное ингибирование в организме, как правило, связано с поступлением в организм тяжелых металлов.

Раздел 5. УГЛЕВОДЫ И ИХ ОБМЕН

Лекция 6. Химическое строение и свойства углеводов

1. Общая характеристика и классификация углеводов

К углеводам относятся соединения, обладающие разнообразными и часто совершенно противоположными свойствами. Среди них есть вещества низкомолекулярные и высокомолекулярные, кристаллические и аморфные, хорошо растворимые в воде и совершенно в ней нерастворимые, способные окисляться и сравнительно устойчивые к действию окислителей.

Общая формула, характерная для подавляющего числа углеводов, С n (Н 2 О) m

По химической природе углеводы делятся на:

· моносахариды (простые сахара);

· олигосахариды;

· полисахариды.

Моносахариды содержат 3-8 атомов углерода и не подвергаются гидролизу с образованием простых углеводородов.

Олигосахариды – полимеры моносахаридов, которые содержат 2-10 остатка моносахаров.

Полисахариды – полимеры моносахаридов, которые содержат более 10 остатков моносахаров.

2. Строение, свойства и функции моносахаридов

Моносахариды делятся на следующие группы:

1. По количеству атомов углерода:

· Триозы (3)

· Тетрозы (4)

· Пентозы (5)

· Гексозы (6)

· Гептозы (7)

· Октозы (8)

2. По химическому строению:

· Альдозы

Все моносахариды являются спиртами, либо альдегидоспиртами, либо кетоспиртами. В их молекулах, как правило, количество атомов углерода равно количеству молекул воды (т.е. m = n).

D-глюкоза (альдоза) D-фруктоза (кетоза)

Альдозы и кетозы являются изомерами.

Основные химические свойства моносахаридов:

1.Мутаротация – переход аномера из одной формы в другую (например, α-глюкоза →β-глюкоза). Аномерами называют энантиомерные формы моносахаридов, различающиеся положением полуацетального гидроксила.

2. Восстановление до многоатомных спиртов (например, глюкоза восстанавливается до сорбита, рибоза – до рибита).

3. Окисление с образованием соответствующих кислот (например, в зависимости от окисляемой группы глюкоза может образовывать глюконовую, глюкуроновую и глюкаровую кислоты).

4. Эпимеризация (например, в слабощелочной среде D-глюкоза находится в равновесии с кетогексозой (D-фруктозой) и альдогексозой (D-маннозой).

5. Образование гликозидов. Конденсация аномерной ОН-группы со спиртовой группировкой молекулы приводит к образованию О-гликозидов. Именно за счет этих связей построены олиго- и полисахариды. При взаимодействии аномерной ОН-группы с NH 2 -группой образуются N-гликозиды.

6. Этерификация. Гидроксильные группы моносахаридов образуют эфиры с различными кислотами. В метаболизме особо важную роль играет фосфорилирование сахаров.

7. Способность реагировать с азотсодержащими соединениями при высокой температуре с образованием специфических окрашенных веществ – меланоидинов.

8. Способность глюкозы (и других гексоз) подвергаться расщеплению (путем гликолиза) и сбраживанию микроорганизмами.

Основные функции моносахаридов:

1. Энергетическая (моносахариды легко расщепляются с выделением энергии, которая затрачивается на образование АТФ).

2. Пластическая (метаболическая). Моносахариды являются предшественниками для образования многих важных веществ: резервных и структурных полисахаридов, аминокислот, жирных кислот, глицерина и др.

3. Строение, свойства и функции олигосахаридов

Олигосахариды различаются по следующим показателям:

1. Количество моносахаридов.

2. Качественный состав.

3. Характер гликозидной связи между моносахаридами.

В растворах моносахариды всегда присутствуют в циклической форме; в состав олиго- и полисахаридов они также входят в циклической форме.

Первый углеродный атом, соединенный с кислородом, является наиболее реакционноспособным. Как правило, связь образуется за счет гликозидного (полуацетального) гидроксила.

Для олигосахаридов характерны некоторые свойства, отмеченные для моносахаридов. Следует также отметить, что олигосахариды, поступающие в организм человека с пищей, в желудочно-кишечном тракте подвергаются гидролизу до своих структурных блоков – моносахаридов. Поэтому в клетки они попадают уже в виде простых сахаров и, соответственно, выполняют те же функции, что и моносахариды.

Из олигосахаридов наибольшее распространение получили дисахариды. Рассмотрим химический состав наиболее важных из них.

Сахароза состоит из остатков α-глюкозы и β-фруктозы, соединенных β-гликозидной (или фруктозидной) связью. Гидролиз сахарозы происходит при участии фермента инвертазы (сахаразы):

сахароза α-глюкоза β-фруктоза

Инвертаза в больших количествах содержится в дрожжах и в кишечнике организмов. Смесь глюкозы и фруктозы в равных количествах, которая образуется при гидролизе сахарозы, называется инвертным сахаром.

Мальтоза – дисахарид, состоящий из 2-х остатков α-глюкозы. Это основной продукт гидролиза крахмала.

Мальтоза → α-глюкоза + α-глюкоза

Гидролиз мальтозы проходит при участии фермента мальтазы.

Мальтаза есть в слюне и поджелудочном соке.

Лактоза – молочный сахар, образуется в организме животных.

Лактоза = β-галактоза + α-глюкоза.Гидролиз лактозы катализируется ферментом лактазой.

Лактаза очень активна у младенцев; у некоторых взрослых лактаза не сохраняется, что влечет за собой непереносимость молока.

4. Строение, свойства и функции полисахаридов

Полисахариды подразделяются на гомосахариды и гетеросахариды.

В состав гомосахаридов входят моносахариды одного типа. Если мономер–фруктоза, то полисахарид нзывается фруктан; галактоза – галактан; глюкоза – глюкан.

Мономерами гетерополисахаридов являются моносахариды 2-х или нескольких типов. К примеру, арабиноза и глюкоза входят в состав арабиноглюканов; арабиноза и ксилоза – арабиноксиланов.

Крахмал (гомосахарид) – запасной полисахарид растений; существует в 2-х формах: амилоза и амилопектин.

Амилоза – линейный полисахарид, состоит из остатков α-глюкозы, соединенных α –1, 4 связью.

Амилопектин – разветвленный полисахарид, в котором на каждые 12 остатков глюкозы, соединенных α –1, 4 связью, приходится α –1, 6 связь.

Эти вещества сильно различаются по своим физическим и химическим свойствам. Так, например, от йода амилоза окрашивается в синий цвет, а амилопектин – в красно-фиолетовый. Они различаются и по растворимости: амилоза легко растворяется в теплой воде и дает растворы со сравнительно невысокой вязкостью, в то время как амилопектин растворяется в воде лишь при нагревании под давлением и дает очень вязкие растворы.

Гликоген («животный крахмал») – по строению сходен с крахмалом, но характеризуется большей разветвленностью.

Является резервным питательным веществом (образуется главным образом в печени и мышцах).

Целлюлоза (клетчатка) – полисахарид, состоящий из большого количества остатков β-глюкопиранозы.

Функции полисахаридов:

1. Запас питательных веществ (крахмал, гликоген – наиболее распространенные вещества).

2. Источники энергии (при использовании их в качестве источников энергии они должны сначала подвергаться расщеплению до моносахаридов).

3. Структурная (целлюлоза – образует клеточные стенки у растений, хитин – у животных, муреин – у бактерий).