Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации субстратов, ферментов, температуры. Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации субстрата, среды и температуры

Ферментативная кинетика изучает влияние различных факторов (концентрация S и E, рН, температура, давление, ингибиторы и активаторы) на скорость ферментативных реакций. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, позволяющей глубже понять механизм действия ферментов.

Кинетическая кривая позволяет определить начальную скорость реакции V 0 .

Кривая субстратного насыщения.

Зависимость скорости реакции от концентрации фермента.

Зависимость скорости реакции от температуры.

Зависимость скорости реакции от рН.

Математическое описание кривой субстратного насыщения, константа Михаэлиса .

Оценки Km имеют практическую ценность. При концентрациях субстрата в 100 раз превышающих Km, фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максимальная скорость V MAX будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Кроме того, Km является характеристикой фермента, что используется для диагностики энзимопатий.

Ингибирование активности ферментов.

Чрезвычайно характеристикой и важной особенностью ферментов является их инактивация под влиянием определенных ингибиторов.

Ингибиторы – это вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами.

Ингибирование ферментативной активности может быть необратимым или обратимым, конкурентным или неконкрентным.

Необратимое ингибирование – это стойкая инактивация фермента, возникающая в результате ковалентного связывания молекулы ингибитора в активном центре или в другом особом центре, изменяющим конформацию фермента. Диссоциация столь устойчивых комплексов с регенерацией свободного фермента практически исключена. Для преодоления последствий такого ингибирования организм должен синтезировать новые молекулы фермента.

Обратимое ингибирование – характеризуется равновесным комплексообразованием ингибитора с ферментом за счет нековалентных связей, вследствие чего такие комплексы способны к диссоциации с восстановлением активности фермента.

Классификация ингибиторов на конкурентные и неконкурентные основана на том, ослабляется (конкурентное ингибирование ) или не ослабляется (неконкурентное ингибирование ) их ингибирующие действие при повышении концентрации субстрата.

Конкурентные ингибиторы – это, как правило, соединения, структура которых сходна со структурой субстрата. Это позволяет им связываться в том же активном центре, что и субстраты, препятствуя взаимодействию фермента с субстратом уже на стадии связывания. После связывания ингибитор может быть превращен в некий продукт или остается в активном центре, пока не произойдет диссоциация.

Обратимое конкурентное ингибирование можно представить в виде схемы:

E↔ E-I → E + P 1

S (неакт)

Степень ингибирования фермента определяется соотношением концентраций субстрата и фермента.

Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малатом, который вытесняет сукцинат из субстратного участка и препятствует его превращению в фумарат:

Ковалентное связывание ингибитора в активном центре приводит к инактивации фермента (необратимое ингибирование). Примером необратимого конкурентного ингибирования может служить инактивация триозофосфатизомеразы 3-хлорацетолфосфатом. Этот ингибитор является структурным аналогом субстрата – диоксиацетонфосфата и необратимо присоединяется к остатку глутаминовой кислоты в активном центре:

Некоторые ингибиторы действуют менее избирательно, взаимодействуя с определенной функциональной группой в составе активного центра разных ферментов. Так, связывание йодацетата или его амида с SH-группой аминокислоты цистеина, находящийся в активном центре фермента и принемающей участие в катализе, приводит к полной утрате активности фермента:

R-SH + JCH 2 COOH → HJ + R-S-CH 2 COOH

Поэтому эти ингибиторы инактивируют все ферменты, которые имеют SH-группы, участвующие в катализе.

Необратимое ингибирование гидролаз при действии нервно-паралитических газов (зарин, зоман) обусловлено их ковалентным связыванием с остатком серина в активном центре.

Метод конкурентного ингибирования нашел широкое применение в медицинской практике. Сульфаниламидные препараты – антагонисты п-аминобензойной кислоты, могут служить примером метаболизируемых конкурентных ингибиторов. Они связываются с дигидроптератсинтетазой – бактериальным ферментом, осуществляющим превращение п-аминобензоата в фолиевую кислоту, необходимую для роста бактерий. Бактерия погибает в результате того, что связавшийся сульфаниламид превращается в другое соединение и фолиевая кислота не образуется.

Неконкурентные ингибиторы обычно связываются с молекулой фермента в участке, отличном от места связывания субстрата, и субстрат непосредственно не конкурирует с ингибитором. Поскольку ингибитор и субстрат связываются с разными центрами возможно образование как комплекса E-I, так и комплекса S-E-I. Комплекс S-E-I тоже распадается с образованием продукта, однако с меньшей скоростью, чем E-S, поэтому реакция будет замедляться, но не остановится. Таким образом, могут протекать следующие параллельные реакции:

E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P

Обратимое неконкурентное ингибирование встречается сравнительно редко.

Неконкурентные ингибиторы называют аллостерическими в отличие от конкурентных (изостерических ).

Обратимое ингибирование может быть количественно изучено на основе уравнения Михаэлиса-Ментен.

При конкурентном ингибировании V MAX остается постоянной, а Km возрастает.

При неконкурентном ингибировании снижается V MAX при неизменном Km.

Если продукт реакции ингибирует фермент, катализирующий его образование, такой способ ингибирования называется ретроингибированием или ингибированием по принципу обратной связи . Например, глюкоза тормозит глюкозо-6-фосфатазу, которая катализирует гидролиз глюкозо-6-фосфата.

Биологическое значение такого ингибирования – регуляция определенных метаболических путей (см. следующее занятие).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Задание студентам

1. Изучить денатурацию белков под действием растворов минеральных и органических кислот и при нагревании.

2. Обнаружить кофермент НАД в дрожжах.

3. Определить амилазную активность в моче (сыворотке крови).

9. ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ НА ЗАДАЧИ , тестовые вопросы, используемые при контроле знаний на занятии (можно в виде приложения)

10. ХАРАКТЕР И ОБЪЕМ ВОЗМОЖНОЙ УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ

(Указать конкретно характер и форму УИРС: подготовка реферативных выступлений, проведение самостоятельных исследований, имитационная игра, оформление истории болезни с использованием монографической литературы и др. формы)

Кинетика ферментативных реакций. Этот раздел энзимологии изучает влияние хими ческих и физических факторов на скорость ферментативной реакции. В 1913 г. Михаэлис и Ментен создали теорию ферментативной кинетики, исходя из того, что фермент (Е) вступает во взаимодействие с субстратом (S) с образованием промежуточного ферментсубстратного комплекса (ЕS), который далее распадается на фермент и продукт реакции по уравнению:

Каждый этап взаимодействия субстрата с ферментом характеризуется своими константами скорости. Отношение суммы констант скорости распада ферментсубстратного комплекса к константе скорости образования ферментсубстратного комплекса называется константой Михаелиса (Кm). Она определят сродство фермента к субстрату. Чем ниже константа Михаелиса, тем выше сродство фермента к субстрату, тем выше скорость ка тализируемой им реакции. По величине Кm каталитические реакции можно поделить на быстрые (Кm 106 моль/л и меньше) и медленные (Кm 102 до 106).

Скорость ферментативной реакции зависит температуры, реакции среды, концентрации реагирующих веществ, количества фермента и других факторов.

1. Рассмотрим зависимость скорости реакции от количест ва фермента. При условии избытка субстрата скорость реакции пропорциональна количеству фермента, но при избыточном количестве фермента прирост скорости реакции будет сни жаться, поскольку уже не будет хватать субстрата.

2. Скорость химических реакций пропорциональна концентрации реагирующих ве ществ (закон действующих масс). Этот закон применим и для ферментативных реакций, но с определенными ограничениями. При постоян

ных количествах фермента скорость реакции действительно пропорциональна концентрации субстрата, но, только в области низких концен траций. При высоких концентрациях субстрата наступает насыщение фермента субстратом, то есть наступает такой момент, когда уже все мо лекулы фермента задействованы в каталитическом процессе и прироста скорости реакции не будет. Скорость реакции выходит на макси мальный уровень (Vmax) и дальше уже не зависит от концентрации субстрата. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата следует определять в той части кривой, кото рая ниже Vmax. Технически легче определить не максимальную скорость, а ½ Vmax. Этот параметр является главной характеристикой ферментативной реакции и дает возможность определить константу Михаелиса (Кm).

Кm (константа Михаэлиса) – это такая концентрация субстрата, при которой ско рость ферментативной реакции равна по ловине максимальной. Отсюда выводится уравнение Михаэлиса–Ментена скорости ферментативной реакции.

Зависимость скорости реакции от концентрации фермента и концентрации субстрата (кинетика ферментативных реакций) представлена на графиках.

график 1 график 2

В ферментативной реакции (F+S 2 ó 1 FS→ 3 F + P) выделяют скорости трёх составляющих этапов:

1- образование фермент-субстратного комплекса FS,

2- обратный распад фермент – субстратного комплекса,

3 – распад фермент-субстратного комплекса с образованием продуктов реакции. Скорость каждой из этих реакций подчиняется закону действующих масс:

V 1 = К 1 [F]* [S]

V 2 = K 2 *

В момент равновесия скорость реакции образования FS равна сумме скоростей его распада: V 1 = V 2 +V 3 . Из трёх этапов ферментативной реакции наиболее важным и медленным является третий, так как он связан с образованием продуктов реакции. По приведенной выше формуле найти скорость V 3 невозможно, так как фермент- субстратный комплекс очень неустойчив измерение его концентрациизатруднено. В связи с этим, Михаэлис-Ментен ввели Кm – константу Михаэлиса и преобразовали уравнение для измерения V 3 в новое уравнение, в котором присутствуют реально измеримые величины:

V 3 = K 3 * * [S] / Km +[S] или V 3 =V max * [S] / Km+[S]

– исходная концентрация фермента

Кm – константа Михаэлиса.

Физический смысл Кm: Кm = (К 2 +К 3) /К 1 . Она показывает соотношение констант скоростей распада фермент-субстратного комплекса и константы скорости его образования.

Уравнение Михаэлиса-Ментен является универсальным. Оно иллюстрирует зависимость скорости реакции от от [S]

1. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. Эта зависимость выявляется при малых концентрациях субстрата [S]V 3 = K 3* * [S] /Km. В данном уравнении K 3 , F 0 ], Km – константы и могут быть заменены новой константой К*. Таким образом, при малой концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна этой концентрации V 3 = K* * [S]. Эта зависимость соответствует первому участку графика 2.

2. Зависимость скорости от концентрации фермента проявляется при высокой концентрации субстрата. S≥Km. В этом случае можно пренебречь Km и уравнение преобразуется в следующее: V 3 = K 3* (( * [S]) /[S]) =K 3* = V max . Таким образом, при высокой концентрации субстрата скорость реакции определяется концентрацией фермента и достигает максимального значения V 3 = K 3 =V max . (третий участок графика 2).

3. Позволяет определить численное значение Km при условии V 3 = V max /2. В этом случае уравнение приобретает вид:

V max /2 = ((V max *[S])/Km+[S]), откуда следует, что Km=[S]

Таким образом, Кm численно равна концентрации субстрата при скорости реакции, равной половине максимальной. Кm является очень важной характеристикой фермента, она измеряется в молях (10 -2 – 10 -6 моль) и характеризуют специфичность фермента: чем ниже Km, тем выше специфичность фермента.

Графическое определение константы Михаэлиса.

Удобнее использовать график, представляющий прямую линию. Такой график предложен Лайнуивером – Берком (график двойных обратных величин), который соответствует обратному уравнению Михаэлиса - Ментен

ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КИНЕТИКА

изучает закономерности протекания во времени ферментативных р-ций, а также их механизм; раздел кинетики химической.

Каталитич. цикл конверсии в-ва S (субстрата) в продукт P под действием фермента E протекает с образованием промежут. соед. X i :

где ki - константы скорости отдельных элементарных стадий, образования фермент-субстратного комплекса X 1 (ES, комплекс Михаэлиса).

При данной т-ре скорость р-ции зависит от концентраций фермента, субстрата и состава среды. Различают стационарную, предстационарную и релаксационную кинетику ферментативных р-ций.

Стационарная кинетика. В стационарном состоянии по промежуточным соед. (dX i /dt = 0, i = 1, ..., n ) и при избытке субстрата , где [S] 0 и [E] 0 - начальные концентрации соотв. субстрата и фермента, кинетика процесса характеризуется постоянным, неизменным во времени уровнем концентраций промежут. соед., а выражение для скорости процесса v 0 , наз. начальной стационарной скоростью, имеет вид (ур-ние Михаэлиса- Ментен):

(1)

где значения k кат и К м -> ф-ции констант скорости элементарных стадий и заданы ур-нениями:

Величину k кат наз. эффективной каталитич. константой скорости процесса, параметр К м -> константой Михаэлиса. Значение k кат определяется величинами наиб. медленных стадий каталитич. р-ций и иногда наз. числом оборотов фермента (ферментной системы); k кат характеризует число каталитич. циклов, совершаемых ферментной системой в единицу времени. Наиб. распространены , имеющие значение k кат. для специфич. субстратов в диапазоне 10 2 -10 3 с -1 . Типичные значения константы Михаэлиса лежат в интервале 10 -3 - 10 -4 M.

При больших концентрациях субстрата, когда т. е. скорость р-ции не зависит от концентрации субстрата и достигает постоянной величины, наз. макс. скоростью. Графически ур-ние Михаэлиса - Ментен представляет собой гиперболу. Его можно линеаризовать, используя метод двойных обратных величин (метод Лайнуи-вера - Берка), т. е. строя зависимость 1/vот 1/[S] 0 , или др. методы. Линейная форма ур-ния (1) имеет вид:

(2)

Она позволяет определить графически значения К м и v макс (рис. 1).

Рис. 1. График линейной трансформации ур-ния Михаэлиса - Ментен в двойных обратных величинах (по Лайнуиверу - Берку).

Величина К м > численно равна концентрации субстрата, при к-рой скорость р-ции равна , поэтому К м часто служит мерой сродства субстрата и фермента, однако это справедливо лишь, если

Величины К м > и изменяются в зависимости от значений рН. Это связано со способностью участвующих в катализе групп молекулы фермента изменять свое состояние ионизации и, тем самым, свою каталитич. эффективность. В простейшем случае изменение рН приводит к протонированию или депротонированию, по крайней мере, двух ионизирующихся групп фермента, участвующих в катализе. Если при этом только одна форма фермент-субстратного комплекса (напр., ESH) из трех возможных (ES, ESH и ESH 2) способна превращаться в продукт р-ции, то зависимость скорости от рН описывается ф-лой:

где f = 1 + / и f " = 1 + + K" b /> -т. наз. рН-ф-ции Михаэлиса, а К а, К b и К" a , K" b -> константы ионизации групп аи bсоотв. своб. фермента и фермент-субстратного комплекса. В координатах lg - рН эта зависимость представлена на рис. 2, причем тангенсы углов наклона касательных к восходящей, независимой от рН, и нисходящей ветвям кривой должны быть равны соответственно +1, 0 и -1. Из такого графика можно определить значения рК а групп, участвующих в катализе.

Рис. 2. Зависимость каталитич. константы от рН в логарифмич. координатах.

Скорость ферментативной р-ции не всегда подчиняется ур-нию (1). Один из часто встречающихся случаев - участие в р-ции аллостерич. ферментов (см. Регуляторы ферментов), для к-рых зависимость степени насыщения фермента от [S] 0 имеет негиперболич. характер (рис. 3). Это явление обусловлено кооперативностью связывания субстрата, т. е. когда связывание субстрата на одном из участков макромолекулы фермента увеличивает (положит. кооперативность) или уменьшает (отрицат. кооперативность) сродство к субстрату др. участка.

Рис. З Зависимость степени насыщения фермента субстратом от концентрации субстрата при положительной (I) и отрицательной (II) кооперативности, а также в ее отсутствии (III).

Предстационарная кинетика. При быстром смешении р-ров фермента и субстрата в интервале времен 10 -6 -10 -1 с можно наблюдать переходные процессы, предшествующие образованию устойчивого стационарного состояния. В этом предстационарном режиме при использовании большого избытка субстрата система дифференц. ур-ний, описывающая кинетику процессов, линейна. Решение данного типа системы линейных дифференц. ур-ний дается суммой экспоненциальных членов. Так, для кинетич. схемы, представленной выше, кинетика накопления продукта имеет вид:

где A i -> , b, а n -> ф-ции элементарных констант скорости; -корни соответствующего характеристич. ур-ния.

Величина, обратная , наз. характеристич. временем процесса:

Для р-ции, протекающей с участием nпромежут. соед., можно получить nхарактеристич. времен.

Исследование кинетики ферментативной р-ции в предстационарном режиме позволяет получить представление о детальном механизме каталитич. цикла и определить константы скорости элементарных стадий процесса.

Экспериментально кинетику ферментативной р-ции в предстационарном режиме исследуют с помощью метода остановленной струи (см. Струевые кинетические методы), позволяющего смешивать компоненты р-ции в течение 1 мс.

Релаксационная кинетика. При быстром возмущающем воздействии на систему (изменение т-ры, давления, электрич. поля) время, к-рое необходимо системе для достижения нового равновесия или стационарного состояния, зависит от скорости процессов, определяющих каталитич. ферментативный цикл.

Система ур-ний, описывающая кинетику процесса, линейна, если смещение от положения равновесия невелико. Решение системы приводит к зависимостям концентраций компонентов разл. стадий процесса в виде суммы экспоненциальных членов, показатели экспонент к-рых имеют характер времен релаксаций. Результатом исследования является спектр времен релаксации, соответствующий числу промежут. соед., участвующих в процессе. Величины времен релаксаций зависят от констант скорости элементарных стадий процессов.

Релаксационные методы кинетики позволяют определить константы скорости отдельных элементарных стадий трансформации интермедиатов. Методы изучения релаксационной кинетики имеют разл. разрешающую способность: поглощение ультразвука - 10 -6 -10 -10 с, температурный скачок - 1O -4 -10 -6 с, метод электрич. импульса - 10 -4 -10 -6 с, скачок давления - 10 -2 с. При исследовании кинетики ферментативных р-ций наиб, применение нашел метод температурного скачка.

Макрокинетика ферментативных процессов. Развитие методов получения гетерогенных катализаторов путем иммобилизации ферментов на разл. носителях (см. Иммобилизованные ферменты )обусловило необходимость анализа кинетики процессов с учетом массопереноса субстрата. Теоретически и экспериментально исследованы закономерности кинетики р-ций с учетом эффектов диффузионного слоя и для систем с внутридиффузионными затруднениями при распределении фермента внутри носителя.

В условиях, когда на кинетику процесса влияет диффузионный перенос субстрата, каталитич. эффективность системы уменьшается. Фактор эффективности равен отношению плотности потока продукта в условиях протекания ферментативной р-ции с диффузионно пониженной концентрацией субстрата к потоку, к-рый мог бы реализоваться в отсутствие диффузионных ограничений. В чисто диффузионной области, когда скорость процесса определяется массопереносом субстрата, фактор эффективности для систем с внешнедиффузи-онным торможением обратно пропорционален диффузионному модулю :

где толщина диффузионного слоя, D - коэф. диффузии субстрата.

Для систем с внутридиффузионным торможением в р-циях первого порядка

где Ф т - безразмерный модуль (модуль Тиле).

При анализе кинетич. закономерностей в ферментативных реакторах широкое теоретич. и эксперим. развитие получили "идеальные" модели реакторов, проточный (проточный реактор идеального перемешивания), проточный реактор с идеальным вытеснением, мембранный реактор.

Кинетика полиферментных процессов. В организме (клетке) ферменты действуют не изолированно, а катализируют цепи трансформации молекул. Р-ции в полиферментных системах с кинетич. точки зрения можно рассматривать как последоват. процессы, специфич. особенностью к-рых является ферментами каждой из стадий:

где , соотв. макс, скорость процесса и константа Михаэлиса i -й стадии р-ции соответственно.

Важная особенность процесса - возможность образования устойчивого стационарного состояния. Условием-его возникновения может служить неравенство > v 0 , где v 0 - скорость лимитирующей стадии, характеризуемой наименьшей константой скорости и тем самым определяющей скорость всего последоват. процесса. В стационарном состоянии концентрации метаболитов после лимитирующей стадии меньше константы Михаэлиса соответствующего фермента.

Специфич. группу полиферментных систем составляют системы, осуществляющие окислит.-восстановит. р-ции с участием белковых переносчиков электронов. Переносчики образуют специфич. структуры, комплексы с детерминированной последовательностью переноса электрона. Кинетич. описание такого рода систем рассматривает в качестве независимой переменной состояния цепей с разл. степенью заселенности электронами.

Применение. Ф. р. к. широко используют в исследовательской практике для изучения механизмов действия ферментов и ферментных систем. Практически значимая область науки о ферментах - инженерная энзимология, оперирует понятиями Ф. р. к. для оптимизации биотехнол. процессов.

Лит.: Полторак О. M., Чухрай E. С, Физико-химические основы ферментативного катализа, M., 1971; Березин И. В., Мартинек К, Основы физической химии ферментативного катализа, M., 1977; Варфоломеев С. Д., Зайцев С. В., Кинетические методы в биохимических исследованиях, M.. 1982. С. Д. Варфоломеев.

Химическая энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия . Под ред. И. Л. Кнунянца . 1988 .

Смотреть что такое "ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КИНЕТИКА" в других словарях:

Каталитич. р ция циклич. процесс, складывающийся из ряда элементарных р ций, скорости к рых описываются действующих масс законом. Этот закон имеет простую форму для идеальных газовых смесей, идеальных р ров и идеальных поверхностных слоев.… … Химическая энциклопедия

Кинетика химических реакций, учение о химических процессах о законах их протекания во времени, скоростях и механизмах. С исследованиями кинетики химических реакций связаны важнейшие направления современной химии и химической… … Большая советская энциклопедия

КИНЕТИКА ХИМИЧЕСКАЯ - (от греч. kinesis движение), отдел теоретической химии, посвященный изучению законов хим. реакций. Можно наметить несколько типов хим. взаимодействий и прежде всего отличать реакции, протекающие в гомогенной (однородной) среде, от реакций,… … Большая медицинская энциклопедия

- (биокатализ), ускорение биохим. р ций при участии белковых макромолекул, называемых ферментами (энзимами). Ф. к. разновидность катализа, хотя термин ферментация (брожение)известен с давних времен, когда еще не было понятия хим. катализа. Первое… … Химическая энциклопедия

- (от лат. re приставка, означающая обратное действие, и actio действие), превращения одних в в (исходных соед.) в другие (продукты р ции) при неизменяемости ядер атомов (в отличие от ядерных реакций). Исходные соединения в Р. х. иногда наз.… … Химическая энциклопедия

- (от лат. fermentum закваска) (энзимы), белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Осн. ф ции Ф. ускорять превращение в в, поступающих в организм и образующихся при метаболизме (для обновления клеточных структур, для обеспечения его … Химическая энциклопедия

- (от греч. pharmakon лекарство и kinetikos приводящий в движение), изучает кинетич. закономерности процессов, происходящих с лек. ср вом в организме. Осн. фармакокинетич. процессы: всасывание, распределение, метаболизм и экскреция (выведение).… … Химическая энциклопедия

Данный раздел энзимологии изучает влияние различных факторов на скорость ферментативной реакции. Учитывая общее уравнение ферментативного катализа обратимой реакции превращения одного субстрата в один продукт (1),

следует назвать главные факторы влияния на скорость ферментативной реакции: концентрация субстрата [S], концентрация фермента [E] и концентрация продукта реакции [P].

Взаимодействие некоторых ферментов с их субстратом можно описать гиперболической кривой зависимости скорости ферментативной реакции V от концентрации субстрата [S] (рис.19):

Рис.19.Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

На этой кривой можно выделить три участка, которые можно объяснить по положениям механизма взаимодействия фермента с субстратом: ОА – участок прямо пропорциональной зависимости V от [S], происходит постепенное заполнение активных центров фермента молекулами субстрата с образованием неустойчивого комплекса ES; участок АВ - криволинейная зависимость V от [S], полное насыщение активных центров фермента молекулами субстрата еще не достигнуто. Комплекс ES до достижения переходного состояния является нестабильным, вероятность обратной диссоциации до E и S еще велика; участок ВС - зависимость описывается уравнением нулевого порядка, участок параллелен оси [S], достигнуто полное насыщение активных ферментов молекулами субстрата, V=V max .

Характерная форма кривой описывается математически уравнением Бриггса-Холдейна:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

где Кm - константа Михаэлиса-Ментен, численно равная концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна половине V max .

Чем меньше K m фермента, тем выше сродство фермента к субстрату, тем быстрее достигается переходное состояние для субстрата, и он превращается в продукт реакции. Поиск значений Km для каждого из субстратов фермента с групповой специфичностью важен при определении биологической роли этого фермента в клетке.

Для большинства ферментов невозможно построить гиперболическую кривую (рис.19), В таком случае используется метод двойных обратных величин (Лайнуивера-Бэрка), т.е. строится графическая зависимость 1/[V] от 1/[S] (рис.20). Метод построения таких кривых в эксперименте очень удобен при изучении влияния различных типов ингибиторов на активность ферментов (см. по тексту дальше).

Рис.20. График зависимости 1/[V] от 1/[S] (метод Лайнуивера-Бэрка),

где y-отсекаемый участок - , а x – отсекаемый участок - , тангенс угла α - .

Зависимость скорости ферментативной реакции V от концентрации фермента [E].

Данная графическая зависимость (рис.21) рассматривается при оптимальных температуре и рН окружающей среды, при концентрациях субстрата, значительно превышающих концентрацию насыщения активных центров фермента.

Рис. 21. Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации кофактора или кофермента. Для сложных ферментов, следует учитывать, что дефицит коферментных форм витаминов при гиповитаминозах, нарушение поступления в организм ионов металлов обязательно приводят к уменьшению концентрации соответствующих ферментов, необходимых для течения процессов обмена веществ. Поэтому следует сделать вывод о прямой зависимости активности фермента от концентрации кофактора или кофермента.

Влияние концентрации продуктов на скорость ферментативной реакции. Для обратимых реакций, протекающих в организме человека, необходимо учитывать, что продукты прямой реакции могут быть использованы ферментом в качестве субстратов обратной реакции. Поэтому направление течения и момент достижения V max являются зависимыми от соотношения концентраций исходных субстратов и продуктов реакции. Так, например, активность аланинаминотрасферазы, катализирующей превращение:

Аланин + Альфа-кетоглутарат ↔ Пируват + Глутамат

зависит в клетке от соотношения концентраций:

[аланин + альфа-кетоглутарат] / [пируват+глутамат].

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ. ТЕОРИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

Ферменты, как и небелковые катализаторы, увеличивают скорость химической реакции по причине способности снижать энергию активации этой реакции. Энергия активации ферментативной реакции рассчитывается как разность между значением энергии в системе протекающей реакции достигшей переходного состояния и энергией, определяемой в начале реакции (см. графическую зависимость рис. 22).

Рис. 22. Графическая зависимость энергетического состояния химической реакции без фермента (1) и в присутствии фермента (2) от времени течения реакции.

Работы В. Генри и, в особенности, Л. Михаэлиса, М. Ментен по изучению механизма моносубстратных обратимых ферментативных реакций позволили постулировать, что фермент Е сначала обратимо и относительно быстро соединяется со своим субстратом S c образованием фермент-субстратного комплекса (ЕS):

E + S <=> ES (1)

Образование ЕS происходит за счет водородных связей, электростатических, гидрофобных взаимодействий, в некоторых случаях ковалентных, координационных связей между боковыми радикалами аминокислотных остатков активного центра и функциональными группами субстрата. У сложных ферментов функцию контакта с субстратом может выполнить и небелковая часть структуры.

Фермент-субстратный комплекс затем распадается во второй более медленной обратимой реакции с образованием продукта реакции Р и свободного фермента Е:

ES <=> EР <=>E + P (2)

В настоящее время, благодаря работам выше названных ученых, а также Кейлина Д., Чанса Б., Кошленда Д. (теория «индуцированного соответствия»), существуют теоретические положения о четырёх основных моментах в механизме действия фермента на субстрат, определяющих способность ферментов ускорять химические реакции:

1. Ориентация и сближение . Фермент способен связывать молекулу субстрата таким образом, что атакуемая ферментом связь оказывается не только расположенной в непосредственной близости от каталитической группы, но и правильно ориентированной по отношению к ней. Вероятность того, что комплекс ES достигнет переходного состояния за счет ориентации и сближения, сильно увеличивается.

2. Напряжение и деформация : индуцированное соответствие. Присоединение субстрата может вызывать конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к напряжению структуры активного центра, а также несколько деформируют связанный субстрат, облегчая тем самым достижение комплексом ES переходного состояния. Возникает так называемое индуцированное соответствие между молекулами E и S.